利用RNA-seq技術(shù)分析有機磷農(nóng)藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達基因

包玉龍，董 超，劉嘉琦，周好樂

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

有機磷農(nóng)藥可防止植物產(chǎn)生病蟲害，確保農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。但農(nóng)藥也可通過食物、環(huán)境暴露及職業(yè)接觸等途徑進入人體，導(dǎo)致急性或慢性中毒[1-3]。雖然國內(nèi)外有關(guān)有機磷農(nóng)藥中毒機制的研究很多，但是對有機磷農(nóng)藥中毒發(fā)生在基因水平的改變的研究甚少。已有的有機磷農(nóng)藥對雄性動物生殖影響的研究主要集中在生殖毒性作用方面，這些毒性作用主要表現(xiàn)為精液質(zhì)量下降、增加精子畸形率、降低精子活率和數(shù)量等[4-21]。

該試驗利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）分析有機磷農(nóng)藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達基因，為探索有機磷農(nóng)藥引起雄性小鼠生殖毒性的分子機制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 有機磷農(nóng)藥的篩選。選擇最常用的并已表現(xiàn)出毒性作用的有機磷農(nóng)藥DDV。

1.1.2 動物分組。選擇40只昆明種雄性小鼠，隨機分為對照組和低劑量染毒組、中劑量染毒組、高劑量染毒組。低、中、高劑量染毒組染毒劑量依次為5.0 mg/kg/d、10.0 mg/kg/d和20.0 mg/kg/d。染毒60 d后，以脫頸臼法處死小鼠，采集睪丸組織。

1.1.3 試驗方法。使用天根Total RNA提取試劑盒提取各組小鼠睪丸組織Total RNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢查；NanoPhotometerspectrophotometer檢測RNA純度(OD260/280 及 OD260/230 比值)；Qubit2.0 Fluorometer：RNA濃度精確定量；利用真核生物大部分mRNA都帶有polyA尾的結(jié)構(gòu)特征，通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA進行文庫構(gòu)建，開展Illumina HiSeq轉(zhuǎn)錄組測序分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 Total RNA的提取與鑒定

對提取的總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，每組提取出了18S和28SRNA。NanoPhotometer spectrophotometer檢測RNA純度(OD260/280及 OD260/230比值)。Qubit2.0 Fluorometer：RNA濃度精確定量結(jié)果如表1所示，均達到建立文庫標準。

圖1 各組DDV染毒小鼠睪丸Total RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 各組樣品的濃度及純度

2.2 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

illunina高通量測序儀下機的數(shù)據(jù)通過測序錯誤率檢查、GC含量分布檢查及原始數(shù)據(jù)過濾，獲得后續(xù)分析使用clean reads的數(shù)據(jù)匯總?cè)缦拢?/p>

對照組和三個染毒組的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的解讀分析結(jié)果顯示，低劑量染毒組有46個差異表達基因，其中表達上調(diào)的有29個基因，表達下調(diào)的有17個基因（見圖2）；中劑量染毒組有117個差異表達基因，其中表達上調(diào)的有36個基因，表達下調(diào)的有81個基因（見圖 3）；高劑量染毒組有 117個差異表達基因，其中表達上調(diào)的有36個基因，表達下調(diào)的有81個基因；3種劑量染毒組共有的差異表達基因有7個，并且這7個基因的表達量都下調(diào) （見圖4）。共有的7個基因分別為：Gm14332、Gm6768、Ibs p、4930568A12R ik、Spin2g、RP23-328F4.6和Gm18849（見圖 5）。

圖2 低劑量染毒組與對照組間的差異表達基因維恩圖

圖3 中劑量染毒組與對照組間的差異表達基因維恩圖

圖4 高劑量染毒組與對照組間的差異表達基因維恩圖

圖5 三個染毒組與對照組相比較共有的差異表達基因

3 討論與小結(jié)

目前，關(guān)于有機磷農(nóng)藥對雄性動物生殖影響的研究主要集中在生殖毒性作用方面。例如，葉勁松等人[7]用馬拉硫磷染毒雄性小鼠，證明一定劑量的馬拉硫磷可增高小鼠精子的畸形率。黃斌等人[15]證明，甲基對硫磷能夠阻滯大鼠生精細胞的細胞周期進程，誘導(dǎo)生精細胞凋亡。于燕等[16]用敵敵畏、樂果和馬拉硫磷混配后染毒雄性小鼠，結(jié)果顯示，睪丸及附睪發(fā)生明顯的病理學(xué)變化，各染毒組小鼠的精子活動率顯著降低，精子數(shù)量顯著減少，精子畸形率顯著增高。何軍山[17]、周好樂[18,19]等的研究均證明敵敵畏和敵百蟲可增加小鼠精子的畸形率，具有明顯的生殖毒性效應(yīng)，但就有機磷農(nóng)藥對雄性動物產(chǎn)生生殖毒性效應(yīng)的分子機制仍不十分清楚。該試驗利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù) （RNA-seq）分析了有機磷農(nóng)藥作用下雄性小鼠睪丸組織差異表達基因，以期為探索有機磷農(nóng)藥引起雄性小鼠生殖毒性的分子機制打下基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄組是指在特定條件下細胞或組織中所有的mRNA的集合。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠從整體水平上揭示特定生物學(xué)過程及疾病發(fā)生中的基因表達變化，從而了解其分子機制。RNA-Seq測序技術(shù)是指解讀細胞或組織內(nèi)mRNA、miRNA序列，對RNA的表達量進行定量、發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本的一種技術(shù)。RNA-seq測序技術(shù)已經(jīng)成為基因表達分析最為敏感的工具之一。

本試驗結(jié)果顯示，低劑量染毒組有46個差異表達基因，其中表達上調(diào)的有29個基因，表達下調(diào)的有17個基因；中劑量染毒組有117個差異表達基因，其中表達上調(diào)的有36個基因，表達下調(diào)的有81個基因；高劑量染毒組有117個差異表達基因，其中表達上調(diào)的有36個基因，表達下調(diào)的有81個基因；3種劑量染毒組共有的差異表達基因有7個，并且這7個基因的表達量都下調(diào)。共有的7個基因分別為：Gm14332、Gm6768、Ibsp、4930568A12Rik、Spin2g、RP23-328F4.6和 Gm18849。