謝 陽 袁正洲 劉夢蘭 羅思維 李作孝 （西南醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州646000）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種通過免疫介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)的慢性炎性脫髓鞘為主要病變特點的疾病，它最常見的類型是復發(fā)緩解型（RR），該病的病因及發(fā)病機制尚不明確，但MS 作為一種自身免疫性疾病主要依賴于淋巴T細胞介導的觀點已得到認可，這些活化的T 細胞可直接進入CNS 破壞髓鞘及神經(jīng)元軸突等重要結(jié)構(gòu)，從而導致MS 的發(fā)生發(fā)展，而髓鞘堿性蛋白（MBP）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）作為神經(jīng)元損害及髓鞘脫失的特異性分泌因子在疾病的進展中發(fā)揮著重要的作用［1-2］。而微小RNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，有部分研究提出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的miRNAs 有潛在的免疫誘導作用，可以通過靶向效應對免疫系統(tǒng)中的信號轉(zhuǎn)導分子產(chǎn)生影響參與類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。這可能與高表達的miR-326 可以抑制靶基因產(chǎn)物Ets-1（一種調(diào)節(jié)Th17 分化的負性因子）的表達，T 淋巴細胞的活化，促進炎癥細胞因子的釋放損害髓鞘及神經(jīng)元等結(jié)構(gòu)，從而加重自身免疫性疾病患者病情有關(guān)［4］。但關(guān)于RRMS 患者miR-326 的表達情況與NSE、MBP的關(guān)系目前報道較少，所以本研究通過對RRMS 患者miR-326 水平的變化及其與NSE、MBP 之間的關(guān)系分析，探究miR-326 在RRMS 中的作用，并為MS的發(fā)病機制研究提供更多新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2017 年8 月至2020 年4 月期間就診收治的復發(fā)緩解型MS 患者59 例（RRMS 診斷符合多發(fā)性硬化診斷與治療的中國專家共識［5］），其中RRMS 急性期組 33 例，男 10 例、女 23 例，年齡 21～58 歲，平均（35.47±6.23）歲；RRMS 緩解期組26 例，男8 例、女18 例，年齡 20～56 歲，平均（36.72±5.21）歲。入組標準：①各組患者的臨床資料均完整；②已完善頭顱和全脊髓MRI 檢查；③各組患者均知情同意并簽署了知情同意書；④意識清晰，能完成配合研究者。排除標準：①有嚴重的心肺肝腎等臟器病變；②合并惡性腫瘤者；③有嚴重的感染和意識障礙而不能配合研究者；④有其他自身免疫性疾病者。

同步收集性別、年齡與RRMS 急性期和緩解期組相匹配的 30 例健康體檢者，男 10 例、女 20 例，年齡22～58 歲，平均（36.49±5.27）歲。所有的研究對象和家屬均簽署知情同意書，同時本臨床研究通過了西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.1.2 試劑 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；Trizol LS 購自美國 Invitrogen 公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國TIANGEN 公司；miRNA 熒光檢測試劑盒購自德國QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 血清樣本收集 所有受檢者在清晨抽取5 ml 靜脈血，在室溫中自然凝固15 min，4 000/rmin離心5 min，取出上層血清放在-80℃超低溫冰箱內(nèi)進行存放，采用ELISA 法檢測各組外周血清中NSE、MBP的表達水平。

1.2.2 純化miRNA 和總RNA 將抽取的靜脈血從-80℃冰箱取出，F(xiàn)icoll 分離液將血漿進行分層，具體操作如下：所取樣本融化后加入Trizol LS混勻并進行振蕩，再將0.5 ml 氯仿加入混勻，低溫離心機10 000/rmin 離心10 min，取上清液并加用miRNeasy液，按miRNeasy 快速試劑盒說明書的相關(guān)步驟提取總 miRNA。將提取的 miRNA 放入 30 μl 的 DEPC 水中56℃水浴15 min加速RNA的溶解。

1.2.3 RT-PCR 檢測 提純后的miRNA 使用MMLV 的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成第一鏈cDNA 合成，并使用miRNA 熒光檢測試劑盒，采用SYBR Green 嵌合熒光法的原理完成miRNA 熒光定量檢測。以上的操作過程均按照相關(guān)試劑盒說明書進行，反應體系為 20 μl，引物設計使用 Primer 5.0 軟件完成，具體的引物序列為5'-CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG-3'，定量PCR 的反應條件為95℃ 下處理5 min，然后95℃變性10 s，再經(jīng)退火和延伸60℃36 s，重復進行40 個循環(huán)。所有的數(shù)據(jù)使用ABI 7300 SDSvl. 2x System 軟件進行處理，依靠軟件的自動分析功能獲取相應的Ct 值，將U6 作為內(nèi)參基因，外周血清中miR-326的相對含量差值為2-ΔΔCt，單樣品進行3次的測定后軟件分析獲取出相應Ct平均值。

1.2.4 外周血清中MBP、NSE 的檢測 按照ELISA試劑盒的具體操作說明檢測各組外周血清MBP、NSE的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0對所有數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以表示，均數(shù)間的兩兩比較采用t檢驗，并采用Pearson 檢驗對變量間的關(guān)系進行相關(guān)性分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料的比較 各組患者在性別、年齡及合并基礎疾病的一般資料對比中均無明顯差異（P>0.05），見表1。

表1 各組一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data for each group

2.2 各組外周血清中miR-326、NSE 及MBP 的水平表達 由表2 可以看出，無論在RRMS 的急性期組還是緩解期組，miR-326相對表達量和NSE、MBP的表達水平均顯著高于健康對照組（P均<0.05），而與緩解期組進行比較，RRMS急性期組患者miR-326相對表達量及NSE、MBP的表達也都明顯增高（P均<0.05）。

表2 各組外周血清miR-326、NSE及MBP的表達情況（）Tab.2 Expression of miR-326，NSE and MBP in periph?eral blood of each group（）

表2 各組外周血清miR-326、NSE及MBP的表達情況（）Tab.2 Expression of miR-326，NSE and MBP in periph?eral blood of each group（）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with RRMS remission group，2）P<0.05.

MBP（μg/ L）miR-326NSE（μg/ L）Groups Control（n=30）RRMS acute（n=33）RRMS remission（n=26）1.23±0.366.34±2.014.82±1.32 4.86±0.751）2）55.68±17.291）2）47.05±16.281）2）2.45±0.481）28.51±12.341）23.69±9.321）

2.3 RRMS 急性期及緩解期血清miR-326 水平與NSE、MBP的相關(guān)性分析 由表3可以看出：RRMS患者緩解期組外周血清中miR-326水平與NSE、MBP均呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.742和0.693，P均<0.05），而急性組miR-326的相對表達量與NSE、MBP也呈正相關(guān)關(guān)系（r分別為0.821和0.716，P均<0.05）。

表3 RRMS兩組患者血清miR-326水平與NSE、MBP的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between serum miR-326 level and NSE，MBP in two RRMS groups

3 討論

MS 作為一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘脫失為主要特點的炎癥自身免疫性疾病，研究普遍認為它屬于自身免疫性疾病，但確切的病因和發(fā)病機制尚不清楚。而固有免疫和適應性免疫應答參與了MS 疾病的發(fā)生發(fā)展這一說法得到了公認。而近期越來越多的證據(jù)表明，miRNA 能通過靶向效應對免疫系統(tǒng)中重要的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導分子表達產(chǎn)生影響［6］。而表觀遺傳學的研究發(fā)現(xiàn)某些miRNA 表達的異常與MS、SLE 及RA 等自身免疫性疾病的發(fā)生存在聯(lián)系，它可能通過影響T 細胞、B 細胞及巨噬細胞的分化和激活而調(diào)控免疫效能，這可能與MS 的發(fā)病啟動有關(guān)聯(lián)［7-9］，畢竟CD4+T 細胞介導的免疫失調(diào)被看作為導致MS 發(fā)病的重要因素。其中高表達的miR-326 可以抑制靶基因產(chǎn)物Ets-1（一種調(diào)節(jié)Th17 分化的負性因子）的表達，從而加重自身免疫性疾病患者的病情［4］，研究表明在MS患者的外周血淋巴細胞中出現(xiàn)miRNA-326 的表達與Th17 細胞的分化存在著明顯的正相關(guān)關(guān)系，并在CD4+T 細胞中也通過熒光原位雜交的方法檢測到miRNA-326 與IL-17A 之間的共表達現(xiàn)象，這對于了解MS 的發(fā)病機制及對預后的判斷具有非常重要的臨床指導意義［10-11］。本臨床研究中也發(fā)現(xiàn)在RRMS緩解期和急性期時外周血中miR-326 水平均顯著高于健康對照組，而急性期中升高的更加明顯，說明miR-326參與了MS的發(fā)生發(fā)展。

眾所周知，自身免疫性T 淋巴細胞對機體有直接靶向攻擊作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種自身免疫性疾病中可能存在一些特異性T細胞直接攻擊髓鞘及神經(jīng)元，造成神經(jīng)元內(nèi)細胞的鈣水平顯著升高，最后這些結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的壞死［12-13］?？梢娫贛S 等疾病進展過程中，通過駐留在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的自身免疫性T淋巴細胞不斷地激活活化并釋放出大量的炎癥細胞因子而直接對神經(jīng)元及髓鞘等結(jié)構(gòu)造成嚴重損害，導致病情的進一步加重［14］。作為特異性的神經(jīng)內(nèi)分泌因子，NSE 在正常穩(wěn)定狀態(tài)下特異性地存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細胞及神經(jīng)元中，作為糖酵解關(guān)鍵酶維持著神經(jīng)元的生理功能及穩(wěn)定；而MBP 則是參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘構(gòu)成的一種特異性堿性蛋白，它與髓鞘的脂質(zhì)之間緊密結(jié)合，對CNS 髓鞘的功能與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用［15-17］。當髓鞘甚至神經(jīng)元發(fā)生損害后，NSE 及MBP 可從細胞內(nèi)迅速進入到細胞間隙，進而通過受損的血腦屏障進入到外周血中，所以NSE、MBP 是作為反映CNS 中神經(jīng)元損害的客觀指標［18］。

本研究發(fā)現(xiàn)RRMS患者無論急性期組還是緩解期組比較于健康對照組都存在NSE 及MBP 水平的高表達，以急性期組更為明顯，這說明RRMS患者存在著髓鞘及神經(jīng)元的損害，并且在疾病復發(fā)急性期時損害程度更嚴重，而將上述兩指標與miR-326 的相對表達量行相關(guān)性分析后得出RRMS患者兩組的miR-326 水平與NSE、MBP 的表達均呈正相關(guān)關(guān)系。說明miR-326可能通過免疫介導造成髓鞘及神經(jīng)元損傷而參與了RRMS的發(fā)生發(fā)展。推測其機制可能與miR-326 通過調(diào)節(jié)CD4+T 淋巴細胞的活化，并釋放大量的炎性細胞因子，從而直接對MMRS 患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘及神經(jīng)元進行攻擊造成損害，導致NSE 和MBP 迅速通過受損血腦屏障進入外周血中有關(guān)［19］。

綜上所述，RRMS 患者的外周血清中miR-326的表達水平顯著升高，以急性期更明顯，且miR-326的水平表達與NSE、MBP 均呈正相關(guān)關(guān)系，但有關(guān)MS 發(fā)病與miR-326 之間的具體機制，目前尚不清楚，仍然需要進一步的研究探索。