張勇強(qiáng)，劉蘭俠，朱方建，劉忠明，李玉勤，宦 娣

(蚌埠市第一人民醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000)

表柔比星屬于抗生素類(lèi)抗腫瘤藥，抑制DNA和RNA的合成，對(duì)多種移植性腫瘤均有效。[1-2]鹽酸表柔比星緩釋片是一種的長(zhǎng)效低毒的新型緩釋制劑，該制劑由表柔比星和生物可降解高分子材料組成，表柔比星和輔料具有較強(qiáng)的引濕性，緩釋片在制備、存儲(chǔ)過(guò)程中易吸潮，影響制劑的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響制劑的質(zhì)量。

對(duì)于鹽酸表柔比星緩釋片，目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有法定的水分測(cè)定方法。目前國(guó)內(nèi)常使用的水分測(cè)定方法有卡爾費(fèi)休容量法測(cè)定法，減壓干燥法，烘干法、甲苯法等[3-13]。但是這些方法對(duì)于測(cè)定鹽酸表柔比星緩釋片水分都有其不足之處，如成本高，檢測(cè)不準(zhǔn)確等問(wèn)題?？紤]到制劑的檢測(cè)成本以及精密性和可操作性，故有必要建立一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏的鹽酸表柔比星緩釋片水分的檢測(cè)方法，用于控制本品中的水分。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

微量水分測(cè)定儀(山東三泵科森儀器有限公司)；旋渦混合儀(上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號(hào)XA105DU)；微量進(jìn)樣器：0.5μL、250μL、500μL氣相尖頭進(jìn)樣針(澳大利亞SGE公司)。

1.2 試劑及材料

N-N-二甲基甲酰胺(分析純)(上海優(yōu)試化工有限公司)；無(wú)水甲醇(分析純)(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)；電量法卡爾費(fèi)休試劑(電解液)[格里斯(天津)醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司]。

純化水(實(shí)驗(yàn)室自制)；1.5mL液相色譜進(jìn)樣瓶(上海雷布斯生物科技有限公司)；5A型分子篩(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸表柔比星緩釋片：實(shí)驗(yàn)室自制(批號(hào)20190302，20190504，20190809，20191012)。

2 方法和結(jié)果

2.1 配制混合溶劑

量取N-N-二甲基甲酰胺(DMF)400mL于試劑瓶中，加入無(wú)水甲醇100mL，再加入適量分子篩，混勻，加蓋，密封，待用。

2.2 空白溶劑制備

根據(jù)“2.1”項(xiàng)下方法配制混合溶劑500mL，渦旋10min，為空白溶劑樣。

2.3 供試品制備

取鹽酸表柔比星緩釋片約20mg，精密稱(chēng)定，置進(jìn)樣瓶中，向進(jìn)樣瓶加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑，渦旋10min，使鹽酸表柔比星緩釋片完全溶解，即得供試樣。

2.4 儀器平衡

將“2.1中配制的混合溶劑”作為電解液用注射器(必須干凈、干燥)通過(guò)密封口注入到微量水分測(cè)定儀的陽(yáng)極室內(nèi)，液面高度位于上下刻度線之間(約120mL)，同法向陰極室注入適量試劑，兩室液面高度要保持一致。按規(guī)定組裝微量水分測(cè)定儀，完成后，打開(kāi)電源，開(kāi)始攪拌。儀器此時(shí)為測(cè)量短路狀態(tài)，分多次向陽(yáng)極室注入少量純化水，儀器從測(cè)量短路狀態(tài)變?yōu)檫^(guò)碘狀態(tài)，再多次加入少量純化水，直到儀器工作電壓曲線接近為零點(diǎn)，并達(dá)到水平平衡為止。

2.5 儀器標(biāo)定

當(dāng)儀器達(dá)到初始平衡點(diǎn)且比較穩(wěn)定時(shí)，用0.5μL進(jìn)樣器精密抽取0.1μL的純化水，點(diǎn)擊開(kāi)始，然后把純水注入到陽(yáng)極室內(nèi)(針尖需插入液面以下)，蜂鳴器響，信息提示測(cè)試完畢，連續(xù)標(biāo)定3次，結(jié)果需為100±3μg，RSD<3%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 儀器標(biāo)定結(jié)果

2.6 線性關(guān)系考察

精密稱(chēng)取8份鹽酸表柔比星緩釋片(批號(hào)20190302)，每份約20mg，依次置進(jìn)樣瓶中，編號(hào)1～8號(hào)，分別向進(jìn)樣瓶中精密加入DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑500μL，再向1～8號(hào)進(jìn)樣瓶依次分別精密加入0μL、0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL、1.5μL純化水作為線性標(biāo)曲樣品，所有樣渦旋10min。依次分別精密吸取空白溶劑樣、1～8號(hào)樣品250μL注入陽(yáng)極室進(jìn)行檢測(cè)?？瞻兹軇訖z測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，線性標(biāo)曲樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 空白溶劑檢測(cè)結(jié)果

表3 線性供試樣檢測(cè)結(jié)果

以表3中制劑含水量(試樣理論含水量)為X軸，儀器檢測(cè)(檢測(cè)水量)值為Y軸作散點(diǎn)圖，再用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為Y=0.4658X+155.2720(X為制劑含水量，Y為儀器檢測(cè)水量)；相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，所以該檢測(cè)方法在制劑水分0%～8%內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

2.7 定量限

2015版《中國(guó)藥典》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證規(guī)定量限可按照LOQ=10δ/S公式計(jì)算。式中LOQ：定量限；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。δ可通過(guò)下列方法測(cè)得：測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)代替。由表2和回歸方程相關(guān)數(shù)據(jù)得，δ=1.29 ，S=0.4658，分別代入計(jì)算得：

LOQ=10δ/S=10×1.29/0.465 8=27.7(μg)

考慮到鹽酸表柔比星緩釋片中含水量較少，且供試溶液中含水量越少越容易受到環(huán)境影響，我們將定量限LOQ定為100μg。

2.8 重復(fù)性考察

精密稱(chēng)取鹽酸表柔比星緩釋片(批號(hào)20190302)5份，每份約20mg，分別置于各進(jìn)樣瓶中，編號(hào)1～5號(hào)，每只進(jìn)樣瓶分別精密加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑，渦旋溶解10min。用空白溶液或供試液潤(rùn)洗250μL微量進(jìn)樣器，分別精密吸取250μL注入陽(yáng)極室進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 鹽酸表柔比星緩釋片精密度檢測(cè)結(jié)果

表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：鹽酸表柔比星緩釋片精密度檢測(cè)平均水分為0.60%，RSD為1.91%。精密度符合要求。

2.9 準(zhǔn)確度考察

精密稱(chēng)取鹽酸表柔比星緩釋片(批號(hào)20190302)18份，每份約20mg，編號(hào)1～18號(hào)，分別置于各進(jìn)樣瓶中，每只進(jìn)樣瓶分別精密加入500μL DMF、甲醇(4∶1，v/v)混合溶劑，1～6號(hào)為低水分樣，分別向7～12號(hào)進(jìn)樣瓶中精密加入0.4μL(400μg)純化水，為中水分樣；再分別向13～18號(hào)進(jìn)樣瓶中精密加入0.7μL(700μg)純化水，為高水分樣。渦旋混勻后，再向4～6號(hào)進(jìn)樣瓶中精密加入0.2μL(200μg)純化水，為低水分加標(biāo)樣；向10～12號(hào)進(jìn)樣瓶中分別精密加入0.5μL(500μg)純化水，為中水分加標(biāo)樣，再分別向16～18號(hào)進(jìn)樣瓶中精密加入0.8μL(800μg)純化水，為高水分加標(biāo)樣，將所有樣品渦旋3min。另取3個(gè)1.5mL進(jìn)樣瓶，分別精密加入500mL混合溶劑，渦旋3min，為空白溶劑樣。用空白溶液或供試液潤(rùn)洗250μL微量進(jìn)樣器，分別精密吸取250μL注入陽(yáng)極室檢測(cè)，空白溶劑樣、1～18號(hào)供試樣依次檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表5 鹽酸表柔比星緩釋片準(zhǔn)確度未加標(biāo)樣檢測(cè)結(jié)果

表6 鹽酸表柔比星緩釋片加樣回收率檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：鹽酸表柔比星緩釋片低、中、高樣品平均回收率分別為102.80%、98.50%和98.40%，檢測(cè)結(jié)果均符合要求。

2.10 結(jié)果

分別對(duì)20190504、20190809和20191012批次鹽酸表柔比星緩釋片按照“2.2供試品制備方法”進(jìn)行制備，每批平行樣3份。制備好后，分別精密吸取相應(yīng)的供試品250μL注入陽(yáng)極室進(jìn)行檢測(cè)。3批鹽酸表柔比星緩釋片水分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 三批制劑測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 方法的選擇

參考2015版《中國(guó)藥典》，鹽酸表柔比星原料藥的水分測(cè)定的方法選擇的是卡爾費(fèi)休容量法[13]；在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，我們選擇卡氏容量法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得3批鹽酸表柔比星緩釋片水分含量分別為0.61%，0.61%，0.58%，RSD分別為2.46%，1.95%，2.56%(n=3)；這兩種方法檢測(cè)的結(jié)果相差不大。但是容量法每次檢測(cè)需要消耗10g左右的制劑，由于表柔比星為貴重藥品，價(jià)格昂貴，這種方法檢測(cè)成本較高。而對(duì)于水分測(cè)定的其他方法，如減壓干燥法、烘干法、甲苯法等，考慮到其靈敏度、準(zhǔn)確度以及適應(yīng)性，并不適合用于鹽酸表柔比星緩釋片的水分含量的測(cè)定。所以我們需要找到一種既能準(zhǔn)確、穩(wěn)定檢測(cè)緩釋片中的水分，又能降低檢測(cè)成本的水分測(cè)定方法?？ㄊ蠋?kù)倫滴定法主要用于測(cè)定含微量水分(0.000 1%～0.1%)的供試品，特別適用于測(cè)定化學(xué)惰性物質(zhì)如烴類(lèi)、醇類(lèi)和酯類(lèi)中的水分[15-16]。卡氏庫(kù)侖法在一次檢測(cè)中可以只需要消耗200mg制劑消耗量，大大降低了檢測(cè)成本，但又不影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，非常適合作為鹽酸表柔比星緩釋片的水分檢測(cè)方法。

3.2 檢測(cè)的專(zhuān)屬性

卡氏庫(kù)侖法可適用多種有機(jī)和無(wú)機(jī)物中的水分測(cè)定，但由于各種化合物性質(zhì)存在的差異，只有在卡氏試劑中無(wú)副反應(yīng)無(wú)干擾的情況下，卡氏庫(kù)侖法測(cè)定才是一種專(zhuān)屬性的方法。其檢測(cè)的原則是：1.副反應(yīng)不能生成水；2.樣品也不能消耗碘或釋放碘。在檢測(cè)中主要引起副反應(yīng)和產(chǎn)生干擾的物質(zhì)有：1.鹽、氫氧化物和氧化物；2.酮和醛；3.強(qiáng)酸；4.硅烷醇/硅氧烷；5.含硼化合物；6.金屬過(guò)氧化物；7.消耗碘的物質(zhì)，如鐵鹽、銅鹽、亞硝酸鹽、硫代硫酸鹽；8.強(qiáng)氧化劑。而鹽酸表柔比星緩釋片中的原料藥鹽酸表柔比星以及輔料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)均不屬于這八類(lèi)物質(zhì)，所以卡爾費(fèi)休庫(kù)倫法檢測(cè)鹽酸表柔比星緩釋片中水分具有較強(qiáng)的專(zhuān)屬，可用于制劑水分的測(cè)定。

3.3 溶劑的選擇

溶解溶劑應(yīng)選擇實(shí)驗(yàn)常用有機(jī)溶劑，水分測(cè)定一般都使用無(wú)水甲醇作為溶劑。表柔比星原料藥以及輔料聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在甲醇中具有較大的溶解度，但輔料PLGA不溶于甲醇，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PLGA在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中有較好的溶解度。通過(guò)鹽酸表柔比星緩釋片在無(wú)水甲醇和DMF中溶解性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：先用甲醇溶解鹽酸表柔比星緩釋片再加入適量DMF和先用DMF溶解鹽酸表柔比星緩釋片再加入適量甲醇短時(shí)間內(nèi)均能使溶液由渾濁變澄清。且單純的DMF溶劑鹽酸表柔比星緩釋片渦旋幾分鐘仍不能使溶液澄清，所以選擇DMF、甲醇混合溶劑溶解鹽酸表柔比星緩釋片。配制DMF∶甲醇為1∶4、2∶3、5∶5、3∶2、4∶1(v/v)五種不同比例的混合溶劑，分別溶解一定量鹽酸表柔比星緩釋片。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：DMF∶甲醇=4∶1(v/v)時(shí)緩釋片從破碎溶解到溶液澄清透明所需時(shí)間最短，溶解效果最好；所以選擇DMF、甲醇4∶1(v/v)混合溶劑溶解鹽酸表柔比星緩釋片。

3.4 進(jìn)樣方式

鹽酸表柔比星緩釋片為固體制劑，可以選擇固體進(jìn)樣或液體進(jìn)樣。固體進(jìn)樣需要將鹽酸表柔比星緩釋片在滴定池中溶解，但鹽酸表柔比星緩釋片不能完全溶解于電解液(電量法卡爾費(fèi)休試劑)中，所以無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量，并且加入固體制劑時(shí)需打開(kāi)進(jìn)樣口塞，會(huì)導(dǎo)致大量水蒸氣進(jìn)入滴定池，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。只有將鹽酸表柔比星緩釋片先用溶劑溶解，再精密吸取一定量供試液，通過(guò)微量進(jìn)樣針穿刺進(jìn)樣口膠塞將液體加入到滴定池中。液體進(jìn)樣能夠避免制劑不溶于電解液的困難，且可以減少進(jìn)入滴定池的水蒸氣，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3.5 稱(chēng)量質(zhì)量及溶解時(shí)間的選擇

由于鹽酸表柔比星緩釋片含水量較低，容易受環(huán)境影響，增大了隨機(jī)誤差，故我們需要稱(chēng)取較大的藥量進(jìn)行操作減小誤差。我們稱(chēng)取3份鹽酸表柔比星緩釋片(20mg、30mg、40mg)分別置于3個(gè)1.5mL進(jìn)樣瓶中，再分別加入500μL混合溶劑，渦旋溶解觀察現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：3份鹽酸表柔比星緩釋片都能在500μL混合溶劑中快速崩解，渦旋1min后已基本全部溶解，渦旋10min后制劑消失，全部溶解。靜置1min后，溶液均澄清透明，20mg樣品無(wú)沉淀，30mg樣品有少許沉淀，40mg樣品有較多沉淀。所以檢測(cè)時(shí)我們選擇稱(chēng)取制劑20mg，渦旋溶解時(shí)間為10min。

4 小結(jié)

實(shí)驗(yàn)表明庫(kù)侖滴定法測(cè)量鹽酸表柔比星緩釋片方法適用、穩(wěn)定、可靠；水分含量在0%～8%范圍內(nèi)，制劑水分含量與儀器檢測(cè)值呈良好的線性關(guān)系(r>0.999 8)。檢測(cè)方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度，并且能夠有效減少檢測(cè)過(guò)程中制劑的消耗，可以用于定量檢測(cè)鹽酸表柔比星緩釋片中的水分含量。