中華按蚊含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因的分子特征及表達模式分析

張肖肖, 雷 丹, 李香盈, 陳 斌

(重慶師范大學昆蟲與分子生物學研究所, 媒介昆蟲重慶市重點實驗室, 重慶 401331)

胰蛋白酶(trypsin)是原核和真核生物中最大的絲氨酸蛋白酶(serine protease, SP)超家族的一個家族(Barrett and Rawlings, 1995; Krem and Di Cera, 2001)，常以酶原的形式存在。胰蛋白酶有非常保守的Tryp_SPc催化功能結(jié)構(gòu)域，每個胰蛋白酶都含有由組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和絲氨酸(Ser)組成的催化三聯(lián)體，且每個催化三聯(lián)體殘基被高度保守的氨基酸基序“GDSGGP”(絲氨酸基序)、“TAAHC”(組氨酸基序)和“DIAL”(天冬氨酸所基序)所包圍(Rawlings and Barrett, 1993)。胰蛋白酶在生理上的重要性，特別在脊椎動物的消化功能上的重要性已被深入研究(Freeman and Kim, 1978; Erickson and Kim, 1990; Muhlia-Almazanetal., 2008)。在無脊椎動物中，胰蛋白酶在消化、凝血和纖溶，組織重塑，激素和生長因子的激活以及細胞外基質(zhì)蛋白的降解等方面起著關鍵作用(Borovskyetal., 1988; Gorman and Paskewitz, 2001)，并且研究表明昆蟲胰蛋白酶參與殺蟲劑調(diào)控機制(Silvaetal., 2010; Lietal., 2017)。除了Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域外，不同的胰蛋白酶還含有CLECT, SuShi, CUB和LDLA等結(jié)構(gòu)域(Caoetal., 2015; Yangetal., 2017)。Hobbs等(1992)首次描述了LY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域又被稱為低密度脂蛋白受體YWTD結(jié)構(gòu)域，約為40～60個氨基酸，其中包含保守基序“Tyr-Trp-Thr-Asp”(YWTD)。該結(jié)構(gòu)域已發(fā)現(xiàn)存在于多種蛋白質(zhì)(如果蠅的卵黃蛋白原受體、低密度脂蛋白受體、前表皮生長因子和nidogen蛋白)中(Yamamotoetal., 1984)。由LY結(jié)構(gòu)域與表皮生長因子(EGF)結(jié)構(gòu)域結(jié)合構(gòu)成的表皮生長因子同源域參與組成卵原蛋白受體，該受體參與昆蟲的生殖作用(汪明明等, 2010)。LY結(jié)構(gòu)域在細胞外基質(zhì)成分nidogen蛋白中呈現(xiàn)出緊密的球狀結(jié)構(gòu)，具有結(jié)合層粘連蛋白的功能(Foxetal., 1991)。在低密度脂蛋白受體(LDLR)中，LY結(jié)構(gòu)域會影響到許多家族性高膽固醇血癥的突變(Hobbsetal., 1990; Soutar, 1992)。

中華按蚊Anophelessinensis廣泛分布于東亞和南亞國家，是瘧疾和馬來絲蟲病的重要傳播媒介，是水稻產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢蚊種(Yanetal, 2018)。蚊媒傳染病仍是嚴重的公眾健康威脅，蚊媒病的控制主要依賴對媒介蚊蟲的控制，殺蟲劑仍是媒介蚊蟲控制的主要措施，殺蟲劑抗性是媒介蚊蟲控制的最大單一障礙(Denholmetal., 2002; Colemanetal., 2017)。近年來，我們以中華按蚊為模式種在系統(tǒng)地開展殺蟲劑抗性的分子機制的研究中(Heetal., 2016; Liuetal., 2018; Meietal., 2018; Wangetal., 2018; Wuetal., 2018)，發(fā)現(xiàn)一類僅含有Tryp_SPc和LY結(jié)構(gòu)域的基因，通過NCBI的氨基酸搜索，令人意外的是，沒有發(fā)現(xiàn)在任何其他物種中僅含有Tryp_SPc和LY結(jié)構(gòu)域的基因。本研究的目的在于報道該類基因并分析其分子特征和表達模式。

本研究基于中華按蚊基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Chenetal., 2014; Zhangetal., 2021)，系統(tǒng)地鑒定了中華按蚊含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶(LY-trypsin)基因，研究LY-trypsin基因的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、基因組定位和系統(tǒng)發(fā)育關系，以及LY-trypsin基因在中華按蚊不同發(fā)育時期、不同組織及吸血前后的表達，為進一步研究LY-trypsin基因的功能提供信息基礎。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究使用的中華按蚊基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自重慶師范大學昆蟲與分子生物學研究所，岡比亞按蚊An.gambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti、致倦庫蚊Culexquinquefasciatus和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的基因組數(shù)據(jù)下載來自NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫和VectorBase數(shù)據(jù)庫(http:∥www.vectorbase.org/)。

1.2 中華按蚊LY-trypsin基因的全基因組鑒定

為了鑒定中華按蚊LY-trypsin基因，以黑腹果蠅、岡比亞按蚊、致倦庫蚊和埃及伊蚊中已經(jīng)鑒定出的胰蛋白酶氨基酸序列作為詢問(query)序列通過BLASTP方法搜索基因組數(shù)據(jù)庫中的氨基酸；使用TBLASTN分別搜索CDS和核苷酸數(shù)據(jù)庫，閾值設為1e-5篩選同源基因。從(Pfam version 27.0)(http:∥pfam.xfam.org)中下載Trypsin(Pfam00089).hmm和Tryp_SPc(SMART000020).hmm隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model， HMM)， 在HMMER3軟件程序中通過HMM搜索基因組中的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。在基因組序列搜索中提取CDS左右翼側(cè)區(qū)至少1 200 bp的基因組序列獲取可能的中華按蚊胰蛋白酶基因序列。最后，將以上獲得的中華按蚊胰蛋白酶序列所對應的基因組序列以Fgenesh+在線軟件(http:∥linux1.softberry.com/)預測基因結(jié)構(gòu)，將預測得到的基因序列推導的氨基酸序列返回到GenBank中進行在線比對，進一步驗證是否為胰蛋白酶基因序列。同時使用SMART(https:∥smart.embl.de/)對這些氨基酸序列進行預測，將包含LY結(jié)構(gòu)域(在SMART數(shù)據(jù)庫中注釋為SM000135)的胰蛋白酶基因序列稱為LY-trypsin基因。

1.3 中華按蚊LY-trypsin基因的分子特征分析

將獲得的中華按蚊LY-trypsin基因所編碼的氨基酸序列，通過ProtParam tool(https:∥web.expasy.org/protparam/)和SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線軟件分別對其分子量、分子式、等電點(pI)、信號肽等進行分析。采用預測的中華按蚊LY-trypsin基因的氨基酸序列在GSDS在線軟件中預測外顯子和內(nèi)含子大小和數(shù)目以及內(nèi)含子相位，并在TBtools中可視化進而繪制出示意圖。利用Prosite(https:∥prosite.expasy.org/)和SMART(https:∥smart.embl.de/)在線軟件預測結(jié)構(gòu)域。基于預測的LY-trypsin基因scaffold的位置，用Mapchart和Adobe Photoshop軟件繪制LY-trypsin基因組定位圖。利用MUSCLE軟件對中華按蚊LY-trypsin基因進行多序列比對；并將得出的結(jié)果導入GeneDoc軟件預測其保守區(qū)域。并使用ScanProsite在線軟件預測LY-trypsin基因的催化活性位點以及二硫鍵位置，并在多重序列比對圖中標注出來。

1.4 中華按蚊LY-trypsin基因的系統(tǒng)發(fā)生分析

利用MEGA7.0軟件的Muscle程序?qū)χ腥A按蚊27個LY-trypsin基因的氨基酸序列進行多重序列比對，刪除序列前后比對質(zhì)量不好的區(qū)域，只留下相對質(zhì)量好的區(qū)域，之后在MEGA7.0軟件基于貝葉斯信息準則(BIC)標準計算的model test中預測最佳模型，選用JTT模型，然后用最大似然(maximum likelihood, ML)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用1 000次重復檢驗計算系統(tǒng)進化樹上的bootstrap值(自展值)。利用在線軟件ITOL(http:∥itol.embl.de/)對系統(tǒng)發(fā)育樹進一步修飾與美化。

1.5 中華按蚊LY-trypsin基因的表達模式分析

收集中華按蚊實驗室敏感品系的卵、1-4齡幼蟲、雌蛹、雄蛹、雄成蚊和雌成蚊，成蚊中腸、脂肪體、卵巢、精巢、觸角、表皮、唾液腺和馬氏管，羽化第3天的雌成蚊及吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h的雌成蚊；中華按蚊擬除蟲菊酯抗性品系的4齡幼蟲、雌蛹、雄蛹、雌蚊和雄蚊成蚊的中腸、脂肪體、觸角、表皮和馬氏管，羽化第3天的雌成蚊及吸血后1, 3和12 h的雌成蚊。每個樣品取3個重復。由深圳華大基因利用Illumina HiseqTM2000進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得表達譜數(shù)據(jù)，對中華按蚊27個LY-trypsin基因進行分析。用層次聚類來表示LY-trypsin基因的相對值。根據(jù)表達譜數(shù)據(jù)得到 LY-trypsin各基因FPKM值并計算相應的log2(FPKM+1)，在TBtools軟件中進行Row Scale 標準化，繪制熱圖以此估測各LY-trypsin基因在中華按蚊不同發(fā)育時期和吸血前后中華按蚊雌蚊中的表達趨勢。在TBtools軟件中進行Column Scale列標準化，繪制熱圖以此估測各LY-trypsin基因在中華按蚊不同組織中的表達趨勢。

2 結(jié)果

2.1 中華按蚊LY-trypsin基因的多樣性

中華按蚊基因組中共有27個LY-trypsin基因。依據(jù)在中華按蚊基因組上的scaffold位置、結(jié)構(gòu)域特征以及系統(tǒng)發(fā)育關系把這27個LY-trypsin基因分別命名為AsLY1-27。這27個基因分別編碼329～1 125個氨基酸，分子量在36.8～125.5 kD間，平均分子量為81.2 kD，等電點為4.73～8.94。其中20個LY-trypsin具有信號肽，信號肽長度在10～62個氨基酸之間(表1)。 這27個LY-trypsin都具有Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域；其中有5, 15, 6和1個LY-trypsin分別有1, 2, 3和4個LY結(jié)構(gòu)域，大部分LY-trypsin結(jié)構(gòu)域相同，因此選取了AsLY1,AsLY9,AsLY10和AsLY16作為代表(圖1)。

圖1 中華按蚊含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域類型Fig. 1 Domain types of the encoded products of LY domain-containing trypsin genes in Anopheles sinensisAsLY1, AsLY9, AsLY10和AsLY16為中華按蚊LY-trypsin基因；紅色代表信號肽，綠色代表Tryp_SPc催化功能域，黃色代表LY結(jié)構(gòu)域。AsLY1, AsLY9, AsLY10 and AsLY16 are LY-trypsin genes in An. sinensis. Red stands for signal peptide, green for Tryp_SPc catalytic functional domain, and yellow for LY domain.

2.2 中華按蚊LY-trypsin基因的分子特征

對具有代表性的LY-trypsin基因氨基酸序列進行多重比對分析，它們都有YWTD保守基序(LY基序)，但在不同氨基酸中具有一定的替代現(xiàn)象。此外，這些氨基酸還具有WPWH, CGG, GTVIGFG, MYCA, CN, DC, VDWISR, NLDGS, ELCY, CID, CDSSK和TVFTDVSKY等保守基序。大多數(shù)氨基酸具有含“H”(絲氨酸)、“D”(組氨酸)和“S”(天冬氨酸)催化三聯(lián)體的活性位點，這3個活性位點分別位于TAAHC, DIALL和GDSGG 3個保守序列內(nèi)。半胱氨酸之間形成二硫鍵且出現(xiàn)了不同程度的二硫鍵缺失現(xiàn)象。在C端附近幾乎所有的氨基酸都有一段保守序列WI(圖2)。

圖2 中華按蚊含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因氨基酸序列多重比對Fig. 2 Multiple sequence alignment of the amino acid sequences of LY domain-containing trypsin genes in Anopheles sinensis基因信息同表1; 下同。紅色矩形標注YWTD保守基序(LY基序)；黑色橫線標注其他保守基序；紅色三角形標示含“H(絲氨酸)”“D(組氨酸)”“S(天冬氨酸)”催化三聯(lián)體的活性位點；紅色橫線標注TAAHC, DIALL和GDSGG保守基序。For the gene information, see Table 1. The same below. The red rectangle stands for YWTD motif sequence (LY motif), black horizontal lines for other conserved motifs, red triangle for the active site with the catalytic triad of “H (serine)”, “D (histidine)” and “S (aspartic acid)”, and red horizontal lines for conservative motifs TAAHC, DIALL and GDSGG.

中華按蚊LY-trypsin基因共72個外顯子。其中，4個基因(AsLY18,AsLY25,AsLY26,AsLY27)具有1個外顯子，8個基因(AsLY2,AsLY4,AsLY8,AsLY14,AsLY17,AsLY19,AsLY20,AsLY23)具有2個外顯子，9個基因(AsLY1,AsLY3,AsLY5,AsLY6,AsLY7,AsLY11,AsLY15,AsLY21,AsLY22)均具有3個外顯子，5個基因(AsLY10,AsLY12,AsLY13,AsLY16,AsLY24)有4個外顯子，AsLY9具有5個外顯子(圖3)。中華按蚊LY-trypsin基因共含有43個內(nèi)含子，各基因內(nèi)含子數(shù)在0～4個間，內(nèi)含子長度在62～20 093 bp間，6個基因(AsLY8,AsLY9,AsLY10,AsLY12,AsLY21,AsLY24)具有較長的內(nèi)含子(長902～20 093 bp)，其他LY-trypsin基因的內(nèi)含子長度相對較短(長62～229 bp)(圖3)。內(nèi)含子具有的3種相位(phase 0型、phase 1型和phase 2型)，分別有29, 25和18個LY-trypsin基因具有phase 0型、phase1型和phase 2型內(nèi)含子(圖3)。

圖3 中華按蚊含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子相位Fig. 3 Structure and intron phase of LY domain-containing trypsin genes in Anopheles sinensis0, 1, 2: 內(nèi)含子相位Intron phase.

Scaffold定位分析結(jié)果表明，27個LY-trypsin基因分布在11個scaffold上，部分基因串聯(lián)分布在scaffold上(圖4)。其中AsLY1,AsLY8,AsLY9,AsLY10,AsLY23,AsLY27基因是分別單獨存在于scaffold246, scaffold32, scaffold34, scaffold134, scaffold25, scaffold14上。基因間距小于20 kb的基因定義為基因成簇分布。在scaffold127上，AsLY2和AsLY3基因成簇分布，間距為5.9 kb，與AsLY4基因的間距為46 kb。AsLY6和AsLY7基因成簇分布，間距為0.3 kb，與AsLY5基因的間距為72 kb；在scaffold91上，AsLY11和AsLY12基因成簇分布，間距為0.8 kb；AsLY13和AsLY14基因成簇分布，間距為2.1 kb；在scaffold20上，AsLY18和AsLY19基因成簇分布，間距為10 kb。

圖4 中華按蚊含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因的scaffold定位Fig. 4 The scaffold mapping of LY domain-containing trypsin genes in Anopheles sinensis

2.3 中華按蚊LY-trypsin基因的系統(tǒng)發(fā)育

系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明(圖5)，中華按蚊LY-trypsin基因聚類為4組分支。8個基因(AsLY1,AsLY2,AsLY3,AsLY4,AsLY5,AsLY6,AsLY7,AsLY17)聚類為一支，其bootstrap值為94%。8個基因(AsLY18,AsLY19,AsLY20,AsLY21,AsLY22,AsLY23,AsLY26,AsLY27)聚類為一支，其bootstrap值為66%。AsLY24和AsLY25基因聚類為一支形成單系群，其bootstrap值為89%。9個基因(AsLY8,AsLY9,AsLY10,AsLY11,AsLY12,AsLY13,AsLY14,AsLY15,AsLY16)聚類為一支，其bootstrap值為98%。

圖5 最大似然法推斷的基于氨基酸序列的中華按蚊含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因的系統(tǒng)發(fā)育關系Fig. 5 Phylogenetic relationships of LY domain-containing trypsin genes in Anopheles sinensisusing maximum likelihood method based on amino acid sequence

2.4 中華按蚊LY-trypsin基因的表達模式

研究分析得到27個LY-trypsin基因中超過50%的基因在不同發(fā)育時期(圖6: A)顯示出相似的表達模式。AsLY4-7,AsLY9,AsLY12和AsLY15-16聚類為一支，在幼蟲時期呈現(xiàn)較高的表達水平。AsLY17,AsLY21和AsLY27分別在實驗室敏感品系中華按蚊成蚊期、 蛹期和卵期具有較高水平的表達量。AsLY24在卵期、蛹期和成蚊期均表現(xiàn)出高表達，且在擬除蟲菊酯抗性品系中的表達量明顯高于在敏感品系中的。

AsLY19和AsLY26在實驗室敏感品系中華按蚊成蚊精巢中表現(xiàn)出高水平的表達量，而在脂肪體、表皮、馬氏管、觸角、中腸和卵巢中表現(xiàn)出較低表達水平；AsLY11和AsLY12在實驗室敏感品系中華按蚊成蚊觸角中特異性高表達；AsLY8,AsLY14,AsLY18和AsLY23在實驗室敏感品系中華按蚊成蚊脂肪體中高水平表達；AsLY21在各個成蚊組織部位均有不同程度的表達，尤其在中腸、表皮、馬氏管、脂肪體組織中擬除蟲菊酯抗性品系的表達量也明顯高于敏感品系(圖6: B)。

圖6 含LY結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因在中華按蚊不同發(fā)育時期(A)、成蚊不同組織(B)以及雌成蚊吸血前后(C)的表達模式Fig. 6 Expression profiles of LY domain-containing trypsin genes in Anopheles sinensis at different developmental stages (A),different adult tissues (B), and its female adults before and after blood feeding (C)E: 卵Egg; L1-L4: 1-4齡幼蟲1st-4th instar larva; MP: 雄蛹Male pupa; FP: 雌蛹Female pupa; M: 雄蚊Male adult; F: 雌蚊Female adult. MIG: 中腸Midgut; MAT: 馬氏管Malpighian tubules; OV: 卵巢Ovary; CUT: 表皮Cuticule; FB: 脂肪體Fat body; AN: 觸角Antennae; SAG: 唾液腺Salivary gland; TES: 精巢Testis; PB1, 3, 6, 12, 24, 48: 分別為吸血后1, 3, 6, 12, 24和48 h 1, 3, 6, 12, 24 and 48 h after blood meal, respectively; S: 實驗室敏感品系Susceptible laboratory strain; R: 擬除蟲菊酯抗性品系Pyrethroid-resistant strain.

在雌成蚊吸血前后的表達模式中，AsLY8和AsLY16屬于同一分支，具有相同的表達模式，在雌蚊吸血前進行表達，吸血后不表達。與其他LY-trypsin基因相比，AsLY17在雌蚊吸血前后各時期表達量均較高。AsLY21在雌蚊吸血前后表達量均表現(xiàn)出高水平，并在吸血后出現(xiàn)逐漸下降的表達趨勢。AsLY1,AsLY14,AsLY6和AsLY10聚為一支，均在敏感品系吸血后表達成逐漸上升趨勢，到雌蚊吸血后6 h時達到峰值，但在雌蚊吸血后12 h時表達量有所下降。AsLY18基因僅在敏感品系雌蚊吸血前、雌蚊吸血后1 h、雌蚊吸血后3 h時有所表達。AsLY11,AsLY19和AsLY25基因在擬除蟲菊酯抗性品系吸血前后表達量呈逐漸上升趨勢(圖6: C)。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在已測序的基因組(特別是蚊蟲基因組)中目前只有中華按蚊同時具有LY結(jié)構(gòu)域和Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶基因(圖1)，我們首次命名該類基因為LY-trypsin基因。因為以該類 基因為參考基因在NCBI庫中未發(fā)現(xiàn)其他物種有LY-trypsin基因，就目前所知，僅中華按蚊有。早先的研究曾報道，胰蛋白酶作為絲氨酸蛋白酶家族的一員，其蛋白酶結(jié)構(gòu)域常與A類低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor class A, LDLA), 富含半胱氨酸的清道夫受體(scavenger receptor cysteine-rich, SRCR), kringle, Sushi, EGF, apple和CUB等結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這些結(jié)構(gòu)域作為蛋白酶前肽段的延伸存在于N末端，通常通過共價二硫鍵附著在蛋白酶結(jié)構(gòu)域上(Rawlings and Barrett,1994; Page and Cera, 2008)；其中Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域包含了絕大部分的功能位點，進而執(zhí)行胰蛋白酶的催化功能(季星來和孫之榮, 2001)，因此我們推測LY結(jié)構(gòu)域則可能是保證催化三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能活性。中華按蚊LY-trypsin基因中除了含有Tryp_SPc結(jié)構(gòu)域之外還存在LY結(jié)構(gòu)域，所以與其他胰蛋白 酶相比，本研究數(shù)據(jù)顯示所有LY-trypsin的氨基酸序列長度均大于300個氨基酸。

中華按蚊LY-trypsin基因氨基酸序列的N端和C端均具有兩個保守的半胱氨酸(圖2)，各形成一個二硫鍵，提示其可能有助于維持活性位點元素的構(gòu)象和分子的完整性。中華按蚊LY-trypsin基因具有典型催化三聯(lián)體(絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸)，這與早期的研究發(fā)現(xiàn)(葛釗宇等, 2016)一致，當催化三聯(lián)體任一活性位點缺失或發(fā)生突變時，酶就可能失去催化活性。本研究中超過50%的中華按蚊LY-trypsin具有信號肽(表1)，提示其可能參與各種生理過程，并需要進一步的研究來確定這些基因的功能。中華按蚊LY-trypsin許多基因在染色體上的定位非常接近，并且許多基因在同一scaffold上呈串聯(lián)重復分布(圖4)，提示這些基因可能發(fā)生了基因重復事件。中華按蚊LY-trypsin基因的系統(tǒng)發(fā)育關系明顯形成4個分支，除了AsLY17基因外，其余位于同一Scaffold的LY-trypsin基因都相應地聚類在了一起(圖5)。

中華按蚊LY-trypsin基因不同發(fā)育時期和成蚊不同組織以及雌成蚊吸血前后均有不同程度的表達(圖6)。LY-trypsin基因中超出50%的基因在幼蟲期高表達，這可能與LY結(jié)構(gòu)域的功能有關，但這些酶的特殊功能目前尚未清楚，可能需要通過RNA干擾等研究來進一步驗證。AsLY17僅在成蚊期進行表達，推測可能參與中華按蚊的變態(tài)過程；AsLY12基因僅在觸角中表達，可能與昆蟲的免疫過程有關；AsLY24基因在幼蟲期不表達，說明可能該基因不參與中華按蚊的生長發(fā)育過程。有趣的是，所有LY-trypsin基因均未表現(xiàn)出雄性或雌性特異的表達模式，說明在中華按蚊的繁殖過程中可能不發(fā)揮重要作用。AsLY19在中華按蚊成蚊精巢組織中特異性高表達，該基因可能參與中華按蚊的生殖功能；AsLY8,AsLY14,AsLY18和AsLY23在脂肪體中高表達，則這些基因可能為中華按蚊提供解毒功能及為其生命的周期活動提供各種生物合成的代謝產(chǎn)物；相比其他LY-trypsin基因，AsLY21似乎有更廣泛的生理作用，在中腸、表皮、馬氏管、觸角部位均高表達，而且在擬除蟲菊酯抗性品系中的表達量分別是敏感品系中的4, 1.8, 2和1.4倍，說明該基因可能參與擬除蟲菊酯代謝的調(diào)控；除此之外，AsLY21在精巢和卵巢中的表達是其他基因的幾十倍，說明該基因可能有潛在的生殖功能。相似的組織特異性表達模式和在同一scaffold上的串聯(lián)分布表明AsLY11和AsLY12基因很可能具有相似的功能。AsLY17基因在中華按蚊雌成蚊吸血過程中呈先上升后下降的趨勢，在吸血后3 h時達到峰值，則推測該基因可能參與血液消化。

本研究是首個對中華按蚊LY-trypsin基因的分子特征分析和表達模式的研究，為LY-trypsin基因的進一步研究奠定了信息基礎，并為其他昆蟲中LY-trypsin胰蛋白酶基因/蛋白質(zhì)的未來實驗研究提供了信息框架。