酶法合成糖原狀α-葡聚糖的研究進(jìn)展

劉佳林，柏玉香，李曉曉，孫純銳，邱洪偉，干福良，金征宇,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，食品安全國際聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫 214122；2.諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司，山東 濰坊 262200）

糖原是一種復(fù)雜的高度分支的葡萄糖聚合物（結(jié)合有少量但具有重要作用的蛋白質(zhì)），其中的α-D-葡萄糖單元由α-1,4-糖苷鍵連接組成線性鏈，并通過α-1,4-糖苷鍵作為分支點連接形成糖原β-顆粒[1]，糖原β-顆粒進(jìn)一步通過糖原蛋白（glycogenin，GN）二聚體連接形成粒徑更大的糖原α-顆粒（粒徑最大為300 nm）[2]，在透射電子顯微鏡下呈玫瑰花狀[3]。糖原分子中的α-1,6-糖苷鍵比例約為7%～10%[4]，其分子質(zhì)量范圍為105～108Da[5]。

糖原作為動物和微生物體內(nèi)的主要儲能多糖[6]，是一種無規(guī)則分支的樹狀大分子[7]。天然糖原在生物體內(nèi)具有較低的滲透壓，例如肝細(xì)胞中儲存的糖原相當(dāng)于400 mmol/L的葡萄糖，但對細(xì)胞質(zhì)滲透壓僅為該濃度葡萄糖的4×10-7倍[4]。糖原還具有大量隨機分布的較短側(cè)鏈，使其在水溶液中呈球形構(gòu)象，因此糖原分子具有易溶于冷水并且易與酶接觸的特點[8]。除此之外，還可以在溫和條件下使用無毒成分將功能基團通過化學(xué)反應(yīng)連接至糖原的葡萄糖殘基的羥基部分，或物理地捕獲在其超支化的結(jié)構(gòu)內(nèi)部[9]，從而對多糖鏈進(jìn)行修飾使其功能化。修飾后的糖原仍然可以部分生物降解[10]，因此認(rèn)為糖原適合應(yīng)用于食品及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[11]。

糖原顆粒尺寸的大小與其生物學(xué)功能息息相關(guān)，可以在肝臟等器官中形成較大的顆粒從而緩慢釋放葡萄糖，也可以在肌肉中形成較小顆粒實現(xiàn)葡萄糖的快速釋放[12]。除此之外，其形態(tài)大小很大程度上受到提取方法的限制，既需要排除器官中存在的其他蛋白質(zhì)[13]，熱水、冷酸和熱堿等苛刻條件又可能會導(dǎo)致糖原分子扭曲和降解[14]，復(fù)雜的制備工藝也限制了糖原作為功能性納米材料的應(yīng)用。因此可以根據(jù)不同需求，通過體外合成途徑獲得結(jié)構(gòu)可控的葡聚糖更符合工業(yè)生產(chǎn)的要求[15]。由于化學(xué)合成無法對糖的區(qū)域和立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行控制，因此對碳水化合物構(gòu)型合成具有絕對控制作用的體外酶促合成方法引起了人們的廣泛關(guān)注[16]。

目前，研究人員已通過多種酶促串聯(lián)合成途徑制備了葡聚糖樹狀大分子（glucan dendrimers，GD）、酶促合成糖原（enzymatically synthesized glycogen，ESG）和生物糖原等糖原狀α-葡聚糖，其中生物糖原已作為皮膚保濕成分應(yīng)用于化妝品中，為進(jìn)一步在食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域開發(fā)其他多功能糖原狀α-葡聚糖產(chǎn)品提供了可能。本文介紹并比較了4 種通過體外酶促串聯(lián)反應(yīng)制備糖原狀α-葡聚糖的方法，并進(jìn)一步分析其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和理化特性，然后討論了控制糖原狀α-葡聚糖精細(xì)結(jié)構(gòu)合成的可能性，最后對其應(yīng)用和發(fā)展前景進(jìn)行了介紹和總結(jié)。

1 糖原狀α-葡聚糖的酶法合成

糖原在動物體內(nèi)的合成是由GN表面194 位的酪氨酸與葡萄糖殘基共價結(jié)合開啟，所形成的短糖鏈作為糖原合酶（glycogen synthase，GS）（EC 2.4.1.1）的底物[17]。體內(nèi)合成中，尿苷二磷酸（uridine diphosphate，UDP）-葡萄糖作為葡萄糖殘基供體，在GS和分支酶（branching enzyme，BE）（EC 2.4.1.18）的聯(lián)合作用下形成糖原[4]，根據(jù)糖原的體內(nèi)合成原理，研究者們繼而提出了一系列體外酶促合成方法（圖1[18]）。

圖1 糖原的酶促合成模型[18]Fig.1 Enzymatic synthesis model for glycogen[18]

1.1 磷酸化酶-分支酶合成法

高分子質(zhì)量糖原已通過肌肉來源的GS和肝臟或肌肉來源BE以UDP-葡萄糖作為葡萄糖供體體外制備。由于GS和GP（EC 2.4.1.1）具有相同的受體特異性，可形成基本相同的多糖[19]，因此有學(xué)者提出使用GP取代GS，以可大量獲得的高純度G1P替代UDP-葡萄糖，作為GP催化的葡萄糖殘基供體[20]。

最初，合成糖原是1943年由Cori等在體外以G1P作為起始原料，通過分離自肌肉的GP和分離自大鼠肝臟和兔子心臟的BE協(xié)同作用形成的[21]，并將該方法稱為GP-BE法（圖1B），又可稱為Cori法[18]。之后，其他人使用各種來源的GP和BE重復(fù)了此方法[22]。van der Vlist等[23]報道的一種酶促串聯(lián)反應(yīng)中，使用馬鈴薯GP以G1P作為供體底物，在麥芽七糖的非還原性末端催化α-1,4-線性鏈增長，并使用來源于Deinococcus geothermalis的BE通過改變短寡糖在α-1,6-糖苷鍵的位置引入分支點，得到了分支度為11%的支鏈葡聚糖。

然而，使用來源于馬鈴薯的GP的合成方法獲得的糖原狀α-葡聚糖具有固定的分支度且會被其他碳水化合物所污染。在此基礎(chǔ)上，Ciric等[24]使用來自兔肌肉的GPb代替馬鈴薯GP，得到了分支度可調(diào)（2%～13%）的支鏈葡聚糖。

1.2 蔗糖磷酸化酶-α-葡聚糖磷酸化酶-分支酶合成法

在GP-BE法中以G1P為底物，但G1P昂貴的價格限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用，若添加一種酶可以從廉價原料中獲得G1P便可解決上述問題。Waldmann等[25]報道了以蔗糖為原料使用SP（EC 2.4.1.7）和GP合成直鏈淀粉。SP可以將蔗糖轉(zhuǎn)化為G1P和果糖，這兩種磷酸化酶的協(xié)同作用可以在恒定的無機磷酸鹽濃度下連續(xù)進(jìn)行，不會因磷酸積累而抑制直鏈淀粉的延長。α-1,4-線性葡聚糖（直鏈淀粉樣聚合物）會在低溫下沉淀，但在高溫下該現(xiàn)象會被顯著抑制[26]，因此提高反應(yīng)溫度可以防止沉淀的發(fā)生，保持底物濃度。通過對Streptococcus mutans的SP進(jìn)行隨機和定點誘變構(gòu)建了耐熱的SP[27]，結(jié)合超嗜熱細(xì)菌Aquifex aeolicus中提取的GP和BE在較高溫度下催化轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，可合成理化性質(zhì)和分子形狀與天然糖原相似的糖原狀α-葡聚糖（圖1C），將其命名為GD[28]。并將這種由SP、GP和BE通過酶促串聯(lián)反應(yīng)體外合成方法命名為SP-GP-BE法[29]。

1.3 異淀粉酶-分支酶-麥芽糖轉(zhuǎn)葡萄糖基酶合成法

與糖原體內(nèi)合成法中使用的GS功能相同，GP-BE法和SP-GP-BE法中使用了GP催化α-1,4-葡聚糖鏈的延長，Kajiura等[18]嘗試使用短直鏈淀粉取代延長后的葡聚糖鏈合成糖原狀α-葡聚糖，提出了IAM-BE-AM法。該方法首先使用Pseudomonas amyloderamosa來源的IAM（EC 3.2.1.68）利用淀粉或糊精制備短鏈直鏈淀粉，加熱使IAM失活后，添加Aquifex aeolicus的BE和重組的Thermus aquaticusAM（EC 2.4.1.25）體外合成糖原（圖1D）。將該方法獲得的類似天然糖原分子質(zhì)量的葡聚糖稱為ESG[30]。

在該方法中，由于AM能夠延長BE難以識別的短鏈直鏈淀粉，因此添加該酶可以提高BE的反應(yīng)效率[29]。與SP-GP-BE法的糖原最高產(chǎn)率30%相比，IAM-BE-AM法制備糖原的最高產(chǎn)率可達(dá)到65%[18]。

1.4 淀粉蔗糖酶-分支酶合成法

AS（EC.2.4.1.4）以蔗糖為唯一底物，催化α-1,4-線性葡聚糖的合成并釋放出果糖，在生產(chǎn)新型的樹突狀碳水化合物納米顆粒方面具有很大的潛力。Grimaud等[31]構(gòu)建了來自Neisseria polysaccharea的AS和BE反應(yīng)體系，通過體外模擬糖原生物合成中涉及的延長和分支步驟，以蔗糖為獨特底物，合成了糖原狀α-葡聚糖（圖1E）。它們在溶液中的形態(tài)和構(gòu)象與糖原相似，但與牡蠣糖原和植物糖原相比，合成的α-葡聚糖鏈長分布較窄，分支度較高，相對分子質(zhì)量分布較寬。

2 糖原狀α-葡聚糖的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

2.1 結(jié)構(gòu)特征

與天然糖原相似，糖原狀α-葡聚糖的結(jié)構(gòu)可分為3 個層次：1）葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵連接形成的線性鏈，并通過α-1,6-糖苷鍵作為分支點連接線性鏈；2）多條鏈隨機連接形成了具有一個還原性末端的糖原β-顆粒；3）糖原β-顆粒的較長側(cè)鏈連接形成體積更大的糖原α-顆粒（較少出現(xiàn)），在透射電子顯微鏡下呈玫瑰花狀[32-33]。糖原狀α-葡聚糖的結(jié)構(gòu)模型如圖2[34]所示。與天然糖原相比，最顯著的差別在于天然糖原上還結(jié)合了許多參與其分子形成和降解以及負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)機體功能的蛋白質(zhì)，例如GN、GS和肌動蛋白等[4]。

圖2 糖原狀α-葡聚糖結(jié)構(gòu)模型[34]Fig.2 Structural model of glycogen-like α-glucan[34]

2.1.1 表觀結(jié)構(gòu)

通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，多數(shù)糖原狀α-葡聚糖顆粒呈稍微扭曲的圓形，其粒徑為20～40 nm（圖3C～E）[33]，形狀與先前報道的天然糖原β-顆粒相似（圖3A、B），由于天然糖原分子容易在提取過程中受到損傷，因此目前市場上銷售的天然糖原顆粒通常較?。ㄈ鐖D3B所示的指甲履螺糖原）。對不同分子質(zhì)量的糖原狀α-葡聚糖進(jìn)行小角X射線衍射（small angle X-ray scattering，SAXS）分析，發(fā)現(xiàn)隨著分子質(zhì)量的增加該α-葡聚糖的形狀愈發(fā)趨于球形[28]。Ciric等[35]通過GP-BE法，在特定反應(yīng)條件下（反應(yīng)時間為72 h，單體與引物的物質(zhì)的量濃度比為300∶1，平均支化度為12%）合成了類似天然糖原α-顆粒的玫瑰花狀α-葡聚糖（圖3F），并發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量高于其他樣品[32]。但研究者們分析認(rèn)為該糖原狀α-葡聚糖的α-顆粒與天然糖原α-顆粒的形成方式不同，該顆?？赡苁翘窃?顆粒中的較長側(cè)鏈通過α-1,4-糖苷鍵連接形成的，此結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步的研究。

圖3 天然糖原及糖原狀α-葡聚糖的透射電子顯微鏡圖像Fig.3 Transmission electron microscopic images of naturally occurring glycogen and glycogen-like α-glucan

2.1.2 分子質(zhì)量

不同來源的天然糖原和通過不同方法制備的糖原狀α-葡聚糖結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示。α-葡聚糖的重均分子質(zhì)量可使用高效排陰色譜法進(jìn)行檢測。天然糖原與糖原狀α-葡聚糖的重均分子質(zhì)量均在105～108Da范圍內(nèi)，天然糖原的重均分子質(zhì)量主要取決于來源和合成方法，而糖原狀α-葡聚糖的重均分子質(zhì)量則取決于合成條件[28]。

2.1.3 分支度

α-葡聚糖的分支度可通過氫核磁共振確定。糖原狀α-葡聚糖的分支度介于8%～12%之間，部分樣品高于天然糖原（8%～10%）。由于生物體內(nèi)的天然糖原在不斷地合成與分解，因此很難提高其分支度；而在糖原狀α-葡聚糖的體外合成方法中，雖然可以通過改變合成條件提高其分支度，但很難突破其峰值（12.6%），可能是由于分支鏈的密集分布會限制BE的作用空間[24]。

2.1.4 鏈長分布

當(dāng)使用IAM完全水解α-葡聚糖的α-1,6-糖苷鍵后，可使用高效陰離子交換色譜法檢測其鏈長分布。研究發(fā)現(xiàn)與天然糖原相比，糖原狀α-葡聚糖的鏈長分布較窄，最長為14 個葡萄糖殘基，具有7 個葡萄糖殘基的葡萄糖鏈數(shù)目最多[23]。此外，在SP-GP-BE法和IAM-BE-AM法中發(fā)現(xiàn)平均鏈長具有隨分支度的增加而減少的趨勢。該特點是BE的底物特異性導(dǎo)致的，Grimaud等[31]認(rèn)為BE和AS對支鏈淀粉多糖具有親和力，優(yōu)先識別具有一定分支度的α-葡聚糖而不是繼續(xù)延長和支化線性鏈。再加上BE無法作用于過短的線性鏈，從而無法合成具有更短分支鏈的葡聚糖。

2.1.5 粒徑

α-葡聚糖的流體力學(xué)半徑（hydrodynamic radius，Rh）可通過光散射法測量獲得。由表1可知，在同一合成方法下糖原狀α-葡聚糖的Rh隨著分子質(zhì)量的增加而增加，從而可根據(jù)不同的需求獲得Rh為8.5～43.5 nm的產(chǎn)品。對顆粒粒徑的控制有利于糖原狀α-葡聚糖作為納米載體進(jìn)行靶向施藥[38]。

表1 天然糖原和糖原狀α-葡聚糖的結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Structural parameters of naturally occurring glycogen and glycogen-like α-glucans

2.2 理化性質(zhì)

2.2.1 消化特性

天然糖原與糖原狀α-葡聚糖通過α-淀粉酶水解后得到的最終產(chǎn)物都包含了葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和高度分支的糊精分子。不同的是，天然糖原產(chǎn)生的糊精分子重均分子質(zhì)量僅為10 kDa，而糖原狀α-葡聚糖產(chǎn)生了更大的糊精分子（重均分子質(zhì)量為1 000～1 600 kDa）[39]。出現(xiàn)此差別的原因是糖原狀α-葡聚糖分子中相鄰的兩個α-1,6-糖苷鍵之間僅有0～2 個α-1,4-糖苷鍵，從而防止α-淀粉酶作用于葡聚糖分子的核心區(qū)域[32,41]。

為了測試口服糖原和糖原狀α-葡聚糖通過胃腸系統(tǒng)時的降解程度，研究人員使用抗性淀粉檢測試劑盒（胰α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的混合物）評估淀粉類食品的膳食纖維含量。在酶法合成糖原樣品中檢測到相當(dāng)數(shù)量的膳食纖維（16.9%～22.1%），而天然糖原卻極少（低于0.2%）[39]。

2.2.2 溶解特性

與天然糖原相同，糖原狀α-葡聚糖易溶于水，水溶液呈乳白色，加入碘液后顯示紅棕色[32,42]。此外，由于糖原狀α-葡聚糖分子呈球形并具有致密的分支結(jié)構(gòu)[32]，與其他溶液黏度較高的分子比，其鏈長較短，減少了與其他聚合物間的纏結(jié)，因此其固有黏度非常低，并且沒有分子質(zhì)量依賴性。質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20%的水溶液顯示出低黏度（低于70 mPa·s），質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于20%時，溶液黏度急劇增加[33]。

3 糖原狀α-葡聚糖酶法合成的結(jié)構(gòu)控制

天然糖原復(fù)雜的體內(nèi)合成途徑發(fā)生在糖原代謝的細(xì)胞區(qū)域中，該區(qū)域中的膜以及代謝調(diào)控作用都會限制其分子質(zhì)量的大小[31]，此外，提取糖原的結(jié)構(gòu)取決于來源和提取方法，再加上提取過程中無法排除痕量的其他物質(zhì)，獲得的每個糖原樣本具有較大差別[32]。因此想要獲得結(jié)構(gòu)明確并可控的糖原，需要通過體外酶促合成途徑。

3.1 底物控制

Kajiura等[18]在IAM-BE-AM法中使用IAM處理DE-9糊精形成不同葡萄糖當(dāng)量的糊精底物。在相同底物濃度下，DE-3糊精（重均分子質(zhì)量為3.54×105Da）和DE-9糊精（重均分子質(zhì)量為4.57×104Da）作為底物時，DE-3糊精產(chǎn)生了較多的平均分子質(zhì)量較低的ESG。而使用不同濃度底物時，發(fā)現(xiàn)在較高的底物濃度下產(chǎn)物的平均分子質(zhì)量較低。此外，不同來源的淀粉因其具有不同的鏈長和直鏈淀粉含量，通過IAM-BE-AM法合成的ESG平均分子質(zhì)量也有所不同。該方法雖然可獲得不同分子質(zhì)量的產(chǎn)物，但以淀粉為原料無法控制脫支處理后產(chǎn)物的分子質(zhì)量，故無法控制產(chǎn)物精細(xì)結(jié)構(gòu)的合成。

有報道指出，串聯(lián)SP-GP合成直鏈淀粉時，通過更改初始蔗糖與引物的濃度比例可以精確控制合成的直鏈淀粉的分子質(zhì)量[26]。因此，添加BE的SP-GP-BE法中，通過控制小分子質(zhì)量的GD（重均分子質(zhì)量為1.22×105Da）和G1P的比例可以制備分子質(zhì)量可控的糖原狀α-葡聚糖[28]。此外，該方法合成的葡聚糖分散系數(shù)較低，是一種均勻聚合物，有利于其進(jìn)一步應(yīng)用。

3.2 反應(yīng)條件

在幾種合成方案中，由于AS可以在沒有葡聚糖的情況下以蔗糖為底物產(chǎn)生直鏈淀粉，因此難以僅通過改變葡聚糖的量對其產(chǎn)物分子質(zhì)量進(jìn)行控制[43]，但可以對天然糖原（例如牡蠣糖原）進(jìn)行修飾。在存在蔗糖作為糖基供體的情況下，使用來自Neisseria polysaccharea的重組AS體外糖基化商用牡蠣糖原，可形成具有特殊核-殼結(jié)構(gòu)的糖原狀α-葡聚糖，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)取決于初始蔗糖與糖原的比例、含量和酶的處理時間[44]。通過AS-BE法制備超支化α-葡聚糖時，Grimaud等[31]認(rèn)為調(diào)整初始蔗糖濃度和兩種酶的比例可以改變產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，提高BE的比例可以提高分支分子的數(shù)量，并使平均粒徑降低，粒徑分布變窄。

分子粒徑的大小不僅取決于分子質(zhì)量，還取決于分支程度，除上述調(diào)控方法外，GP-BE法中當(dāng)使用兔肌肉中的GP時發(fā)現(xiàn)分支度可隨反應(yīng)時間增加而增加，而在相同的反應(yīng)條件以及不同的G1P和麥芽七糖比例下，分支度將隨聚合度的增加而降低[24]。

4 糖原狀α-葡聚糖應(yīng)用前景

Kajiura等[30]于2009年4月對日本有關(guān)公眾對糖原的最新印象進(jìn)行了問卷調(diào)查。調(diào)查結(jié)果顯示，絕大多數(shù)人（85.6%）知道“糖原”一詞，并且將“糖原”一詞與健康聯(lián)系在一起。然而天然糖原從天然物質(zhì)中提取，來源和提取方式不同將影響天然糖原的結(jié)構(gòu)和功能。故ESG狀α-葡聚糖被認(rèn)為是天然糖原的有效替代品，其對人體的健康益處值得進(jìn)一步研究[45]。

急性毒性研究表明，口服ESG在實驗大鼠中表現(xiàn)出非常低的急性毒性，在體外細(xì)菌回復(fù)突變實驗中也未顯示任何誘變特性。并且以20 g/kgmb的劑量進(jìn)行的為期13 周的亞慢性毒性研究中也未發(fā)現(xiàn)具有毒理學(xué)問題，支持其用于食品成分的開發(fā)[41]。

4.1 皮膚保濕劑

近年來，格力高公司推出了由IAM-BE-AM法生產(chǎn)的糖原狀α-葡聚糖作為化妝品成分，將其命名為“生物糖原”。先前的研究發(fā)現(xiàn)，皮膚中糖原的含量會隨著年齡的增長而減少。生物糖原可通過增加皮膚中的透明質(zhì)酸和神經(jīng)酰胺的含量，從而提高化妝品的保濕效果。此外，生物糖原還可抑制中波紅斑效應(yīng)紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）誘導(dǎo)的活性氧的積累增加與抗氧化相關(guān)的蛋白表達(dá)。

4.2 能量補充劑

由于糖原狀α-葡聚糖的高溶解性和低滲透壓特性，可將其溶液用作運動過程中水分和碳水化合物補充劑。在耐力運動員所需的運動飲料中，使用了兩種類型的碳水化合物：一種碳水化合物（例如單糖或二糖）可被迅速吸收；而另一種（如麥芽糖糊精）會在胃腸道中被緩慢吸收。Inagaki等[46]研究認(rèn)為ESG與麥芽糊精一樣吸收速度緩慢，但可維持更長時間的血漿葡萄糖水平，因此可以作為運動飲料中的能量補充劑。

4.3 膳食纖維

在體外消化實驗中發(fā)現(xiàn)，糖原狀α-葡聚糖經(jīng)消化后生成高支化大糊精，因此分析其可能具有膳食纖維的作用。分析化學(xué)家協(xié)會方法2002-02對ESG的評估顯示，ESG含有約20%的膳食纖維，并且通過在大鼠中的單次口服給藥實驗確定，ESG的血糖指數(shù)約為79[47]。ESG未消化的部分可稱為抗性糖原，可通過刺激腸道細(xì)胞激活免疫細(xì)胞[48]、降低抗氧化應(yīng)激和促炎性細(xì)胞因子作為預(yù)防炎癥性腸病的新材料[49]，當(dāng)其到達(dá)盲腸后可被微生物群轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸[47]。多項研究表明，膳食纖維有益于脂質(zhì)代謝[50]。ESG可降低附睪脂肪組織和血漿中的甘油三酯水平，并增加了正常飲食大鼠的高密度脂蛋白/總膽固醇比率[47]，還可顯著減輕腹部脂肪組織的質(zhì)量[51]。因此，飲食中補充ESG可能有助于減少由高脂飲食引起的脂肪組織和肝臟中脂質(zhì)堆積，并降低血漿膽固醇水平[52-53]。

4.4 抗腫瘤活性劑

除可作為膳食纖維外，ESG還可通過刺激宿主免疫反應(yīng)（例如巨噬細(xì)胞）顯示抗腫瘤活性。以50 μg/mL的劑量口服GD可延長荷瘤小鼠的存活時間并防止代謝紊亂[54]。Kakutani等[29]報道了相對分子質(zhì)量約為5.0×106～6.5×106但不超過1.0×107的ESG具有刺激巨噬細(xì)胞的活性，并通過實驗證明其活性取決于其分子質(zhì)量，而不是取決于其精細(xì)結(jié)構(gòu)[55]。因此體外合成糖原狀α-葡聚糖與天然糖原相比，更易對其分子質(zhì)量進(jìn)行控制，有利于其大規(guī)模生產(chǎn)。

4.5 糖綴合物

由于天然糖原是從核心蛋白生長形成的，本身就是一種超支化的糖綴合物。因此，若將酶促反應(yīng)中所需的麥芽寡糖引物衍生化，則可體外合成定義明確的合成超支鏈糖綴合物，有利于進(jìn)一步了解天然糖原的生物合成及其聚集行為。例如van der Vlist等[9]將麥芽七糖分別與丁二胺、三(2-氨基乙基)胺和胺官能化的甲基醚-聚乙二醇偶聯(lián)，形成的3 種麥芽七糖衍生物可以作為引物參與馬鈴薯磷酸化酶與BE催化合成超支化葡聚糖二嵌段共聚物。但值得注意的是，聚乙二醇的存在會降低酶活性和產(chǎn)物分支度。

4.6 蛋白質(zhì)替代物

此外，還可以通過向糖原的非還原端添加官能團來豐富其功能。由于GP具有寬松的糖基供體底物識別特異性[56]，已報道多種使用G1P的類似物底物作為糖基供體，從而通過GP催化的糖基化反應(yīng)在非還原端合成的具有不同糖殘基的非天然寡糖。如圖4所示，熱穩(wěn)定的GP可識別α-D-氨基葡萄糖1-磷酸（α-D-glucosamine 1-phosphate，GlcN-1-P）和α-D-葡萄糖醛酸1-磷酸（α-D-glucuronic acid-1-phosphate，GlcA-1-P），催化GD的連續(xù)葡萄糖醛酰化和葡糖酰胺化作用，以產(chǎn)生在非還原端具有調(diào)節(jié)位置的氨基和羧基的樹突狀兩性α-葡聚糖。由于其與蛋白質(zhì)相似的兩性性質(zhì)，有望替代蛋白質(zhì)應(yīng)用于藥物載體和支架等生物醫(yī)學(xué)材料[57]。

圖4 GD連續(xù)葡糖醛?；推咸酋０坊铣蓸渫粻顑尚驭?葡聚糖示意圖[57]Fig.4 Synthesis of dendritic amphoteric α-glucans by successive glucuronylation and glucosaminylation of GD[57]

4.7 蛋白質(zhì)遞送載體

除上述方法外，還可利用糖原狀α-葡聚糖外圍的大量功能性端基進(jìn)行聚合反應(yīng)或與周圍環(huán)境相互作用，使目標(biāo)物與葡萄糖殘基的羥基部分物理連接或被捕獲在超支化結(jié)構(gòu)內(nèi)部，將其作為一種遞送載體。膽固醇修飾的ESG通過在水中自組裝形成粒徑約35 nm的簇狀納米凝交，該兩親性多糖納米球能夠與多種蛋白質(zhì)穩(wěn)定地絡(luò)合，并具有很高的疏水性。另外，可通過與環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）復(fù)合而形成超分子納米復(fù)合物，用于提高酶熱穩(wěn)定性的人工分子伴侶（圖5）[58]。Takahashi等[59]在此基礎(chǔ)上將N,N-二乙基乙二胺作為陽離子基團引入膽固醇修飾的ESG，合成了陽離子兩親性ESG衍生物。其通過疏水和靜電相互作用與蛋白質(zhì)形成強而穩(wěn)定的復(fù)合物，可以穩(wěn)定地抵抗蛋白質(zhì)熱變性，因此能夠有效地進(jìn)行蛋白質(zhì)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運。也可通GD的羥基與十二烷基異氰酸酯的反應(yīng)合成兩性GD。兩親性GD可有效結(jié)合蛋白，已成功地將β-半乳糖苷酶傳遞到細(xì)胞中，同時保持了酶的活性，因此該分子可也作為蛋白質(zhì)遞送載體[40]。

圖5 CHESG-CD復(fù)合物的形成及其蛋白質(zhì)遞送活性示意圖[58]Fig.5 Schematic representation of the formation of cholesterol groupbearing enzymatically synthesized glycogen-β-cyclodextrin-cyclodextrin complex with protein delivery activity[58]

5 結(jié) 語

為擴大現(xiàn)有的葡萄糖聚合物的應(yīng)用范圍，研究人員參考糖原的體內(nèi)合成方法提出了體外合成糖原狀α-葡聚糖的可能，并隨著研究的深入，不斷拓展合成思路，從GP-BE法中衍生出了SP-GP-BE法、IAM-BE-AM法及AS-BE法。在過去的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)所合成的糖原狀α-葡聚糖具有與天然糖原相似的溶液性質(zhì)和分子形狀，與此同時，他們也意識到其鏈長分布、α-1,6-糖苷鍵的分布以及消化特性與天然糖原具有一定的差異。因此，對于合成的糖原狀α-葡聚糖與天然糖原精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析比較（例如對吸附水分子的氫鍵網(wǎng)絡(luò)及顆粒內(nèi)、外部鏈密度比較等）需要更深入的研究和理解。此外，對合成的糖原狀α-葡聚糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)（如分子質(zhì)量、分子粒徑）控制、生產(chǎn)原料及引物成本降低和產(chǎn)量提高的進(jìn)一步研究，是充分發(fā)揮其在食品、醫(yī)療及化妝品等領(lǐng)域商業(yè)價值的重要基礎(chǔ)，也是今后的主要發(fā)展方向。