四川地區(qū)藏豬戊型肝炎病毒的檢測和遺傳演化分析

曹 慧，楊丹嬌，張 敏，李 平，張朝輝，湯 承,2，張 斌,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041；2.國家民族事務委員會青藏高原動物疫病防控創(chuàng)新團隊，成都 610041；3.四川省甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學研究所，康定 626000；4.四川省甘孜藏族自治州動物疫病預防控制中心，康定 626000)

戊型肝炎(hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E Virus，HEV)引起的一種人和多種動物患病的人獸共患病，一般經(jīng)糞口途徑傳播。人HE在發(fā)展中國家和地區(qū)發(fā)病率達80%以上，致死率為1%左右，懷孕期為6～8月的孕婦死亡率可達20%[1]。目前在我國HE仍以散發(fā)形式流行[2]。過去認為HE流行地區(qū)主要分布在發(fā)展中國家[3-4]，但是近年來在美國、法國、新西蘭、澳大利亞等發(fā)達國家亦有散發(fā)病例報道[5-6]。人們在豬、羊、老鼠等動物中相繼檢測到戊肝病毒[7-9]。

HEV是一種正鏈單股RNA病毒，屬于肝炎病毒科正嗜肝病毒屬[10]。編碼區(qū)由3個部分重疊的開放式閱讀框(ORF1、ORF2 和ORF3)組成。由于該病毒能感染多種動物宿主，跨物種感染很常見，因此HEV的基因組表現(xiàn)出顯著的多樣性?；谶@種序列多樣性，被分為至少8種基因型(1-8)[11-13]。1型和2型HEV僅感染人類，在發(fā)展中國家，由于飲用污染的飲用水而呈地方性流行[14-15]，基因型3和4主要感染人和各種動物，5型和6型主要感野豬，新發(fā)現(xiàn)的7型流行病學分布還不明確，而8型是2016年在我國雙峰駱駝中發(fā)現(xiàn)的另一種新的基因型[11]；這些類型的HEV可通過人畜共患病傳播，在世界范圍內(nèi)引起感染[16]。在我國，基因4型HEV(HEV-4)是主要流行基因型，參與人畜共患傳播[17]，目前已在人和動物中鑒定出9種HEV-4的亞型(HEV-4a至HEV-4i)[18]。豬戊型肝炎可感染人及豬、黑猩猩等多種動物，豬作為僅能感染G3和G4的感染模型，通常表現(xiàn)為隱性，可引起人的高病死率，為一種重要的人獸共患傳染病，因此推測豬源HEV可能是引起人感染戊型肝炎的重要源頭，所以對其流行及傳播進行監(jiān)測具有重要意義。

藏豬是我國唯一生活在青藏高原東南部重要的地方特色豬種，生活在海拔3 000 m以上的高山或河谷地區(qū)[19]，具有適應高海拔惡劣氣候環(huán)境和抗病等特點。藏豬養(yǎng)殖以放牧為主，養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生條件較差，能與人以及其他動物緊密接觸，共用水源或食物，這種養(yǎng)殖模式有利于HEV的流行，也有利于其跨宿主傳播。為了調(diào)查四川地區(qū)藏豬戊型肝炎病毒的流行情況和遺傳演化，本研究對2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個藏豬場332份藏豬糞便樣本進行HEV檢測，并對其進行基因分型后，從每年的毒株中挑出1株典型株進行全基因組擴增以及遺傳進化分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

KOD OneTMPCR Master Mix Blue和Quick Taq HS DyeMix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Trizol總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒和DL2000 DNA Marker購自TaKaRa生物技術有限公司；凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司；TGL-16冷凍離心機購自四川蜀科儀器有限公司；PCR儀購自杭州博日科技有限公司。

1.2 病料的采集與處理

病料為2018—2020年采集自四川省甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個藏豬場332份藏豬糞便樣本，其中健康樣本105份，腹瀉樣本227份，樣本于-80 ℃保存。按1∶5加入PBS震蕩混勻，反復凍融3次后，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設計與合成

參考文獻[20]報道HEV的通用檢測引物為套式PCR引物，擴增產(chǎn)物大小為644 bp，參考文獻[21]發(fā)表的HEV全基因擴增的引物序列(表1)對3份陽性毒株進行全基因組的擴增，引物由北京擎科新業(yè)生物有限公司合成。

表1 HEV全基因擴增引物信息

1.4 核酸的提取及反轉錄

用Trizol法抽提樣本中總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書制備cDNA。反應體系：總RNA 4 μL，5×Buffer 2 μL，oligo(dT)0.5 μL，反轉錄酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL；反轉錄程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。將反轉錄獲得的cDNA放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藏豬腹瀉樣本中HEV陽性率的調(diào)查

以步驟1.3中合成的HEV檢測引物對cDNA樣本進行PCR檢測，PCR反應體系：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反應程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.6 HEV陽性樣本基因分型

用DNAStar等分子生物學軟件，將陽性樣本擴增出的ORF2片段進行拼接，將拼接結果分別與GenBank不同血清型HEV毒株的ORF2進行序列比對，借助線上工具iTOL(http://itol.embl.de/)繪制圓形進化樹，分析其遺傳進化關系，最終確定所有陽性樣本的基因型。

1.7 HEV分歧時間估算

以貝葉斯進化分析軟件(BEAST v1.8.0)的BEAUti程序設置序列的采樣時間、氨基酸置換模型、分子鐘模型、馬爾科夫鏈長和先驗參數(shù)。以BEAST程序運算，通過MCMC方法進行樹的重復抽樣，獲得具有最大后驗概率的進化樹。通過TreeAnnotator程序設置Burnin值。以FigTree v1.4.4軟件對進化樹進行修飾和分歧時間的標定，分析病毒序列的演化過程。

1.8 HEV全基因組序列的擴增

用RT-PCR法對3株典型HEV毒株陽性樣本全基因進行分段擴增，KOD OneTMPCR Master Mix Blue 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：98 ℃ 10 s、62.4 ℃/63.1 ℃/59.4 ℃/61.7 ℃/65 ℃/53.7 ℃ 5 s、68 ℃ 10 s，循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化，按照pMDT19-T Vector Cloning Kit說明書進行連接，并轉化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆送北京擎科新業(yè)生物有限公司進行測序。

1.9 HEV重組分析

為了分析不同來源的HEV毒株之間的遺傳關系和重組關系，以RDP4軟件的Chimaera、MaxChi、RDP、GENECONV、SiScan和3Seq方法對3株擴增全基因組毒株進行重組分析，利用SimPlot程序對每個簇分別進行相似性分析，對重組區(qū)和非重組區(qū)構建獨立的進化樹以驗證重組。

2 結 果

2.1 藏豬HEV的檢出率

利用HEV檢測引物[20]，以RT-PCR方法對22個規(guī)?；i場的332份糞便樣本進行檢測。結果顯示：在糞便樣本中，HEV核酸陽性率為20.48%(68/332，95%CI=16.3%～25.2%)；22個規(guī)模藏豬場中，HEV豬場陽性率為77.27%(17/22,95%CI=54.6%～92.2%)，健康樣本陽性率為2.86%(3/105，95%CI=0.6%～8.1%))，腹瀉樣本陽性率為28.63%(65/227，95%CI=22.8%～35.0%)，結果表明,HEV在四川藏豬中存在且流行。68個陽性樣本中，65份陽性來自腹瀉樣本，3份來自健康樣本，表明HEV可能與腹瀉有關，有待進一步研究。

2.2 藏豬HEV陽性樣本ORF2片段分析及分歧時間計算

通過MEGA對本研究中的68條測序藏豬源HEV序列與23條分型參考序列進行ORF2片段比對，并通過線上工具iTOL(http://itol.embl.de/)繪制圓形進化樹(圖1)。結果顯示，68個序列彼此之間核苷酸序列相似性為69.6%～100.0%，與之前報道的1～4型HEV分離株核苷酸序列相似性為75.1%～90.2%，與4型HEV的相似性最高(82.5%～90.2%)。根據(jù)目前的亞型分型標準，系統(tǒng)進化分析顯示,68株陽性樣本均為G4型，其中4a型HEV毒株在四川地區(qū)藏豬HEV傳播中占有明顯優(yōu)勢。

.4a型；.4b型；●.4 d型；★.4j型；◆.G4型

為進一步研究HEV的進化過程，通過BEAST v1.8.0軟件對87條(其中包括本研究中分別從22個 豬場各挑選1株典型毒株的ORF2部分片段)確定采樣時間的HEV ORF2部分片段進行分歧時間的估算。采用貝葉斯馬爾可夫鏈-蒙特卡羅(MCMC)算法進行分析，通過BEAUti輸出模型的拓撲結構、分支長度和核苷酸替換模型等參數(shù)進行重復抽樣，得到貝葉斯進化樹(圖2)。結果表明,D7-2018分歧時間最早為1999年，K10-2018分歧時間為2008年，其余20支毒株均晚于2010年之后產(chǎn)生分歧，可以觀察到17株病毒的分歧時間除D7-2018外，均晚于世界各地HEV毒株的分歧時間，說明四川藏豬HEV可能是由其他地區(qū)豬群傳染的。

橫坐標為時間刻度，結點處示病毒分化的時間點?！駷楸狙芯慷局?/p>

2.3 3株HEV全基因擴增和序列分析

為獲得藏豬HEV分離株進化關系更精確的信息，從3年采集的所有樣本中，每年挑選1株典型毒株共3株進行全基因的擴增，并成功獲得了3株毒株的全基因序列。將全基因序列命名并上傳至GenBank，分別命名為SWU/31-12/2018、SWU/301/2019和SWU/A/2020。SWU/31-12/2018序列長度為7 208 bp，GC含量為55.15%，登錄號為MK410046；SWU/30/2019序列長度為7 244 bp，GC含量為54.13%，登錄號為MW365405；SWU/A/2020序列長度為7 215 bp，GC含量為54.12%，登錄號為MW365406，3株全基因的相似性為89.5%～93.1%。68株陽性樣本均將ORF2序列測序結果提交至GenBank，登錄號為MK410054～MK410091、MW365407～MW365436。將本研究中3條全基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中其他26條HEV全基因序列構建全基因進化樹(圖3)，結果表明，3株HEV均屬于G4型，且與人的HEV毒株親緣關系最近。

●.本研究擴增的3條HEV全基因序列

2.4 HEV重組分析

通過RDP4和SimPlot軟件對3條HEV序列全基因組進行重組分析，結果顯示,SWU/301/2019的多聚蛋白ORF1片段(圖4A)存在重組，選取重組序列SWU/301/2019、親本序列SWU/B6/2018和次要親本SWU/31-12/2018，利用SimPlot軟件進行相似性分析(圖4B)。以斷點位置為界，將SWU/301/2019序列劃分為重組區(qū)域(3 746—4 655 bp)和兩個非重組區(qū)域(1—3 745 bp，4 656—3′末端)。通過MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining法對SWU/301/2019三個區(qū)域的核苷酸序列(圖4C1、C2、C3)分別構建進化樹，基于重組區(qū)域構建的進化樹與非重組區(qū)域顯示出不一致的遺傳系統(tǒng)發(fā)育關系，進一步支持了SWU/301/2019的重組事件。

A.RDP4重組分析結果；B.SimPlot相似性分析結果；C1、C3.SWU/301/2019非重組區(qū)域構建進化樹；C2.SWU/301/2019重組區(qū)域構建進化樹

3 討 論

HEV引起的戊型肝炎是一種自限性疾病，作為人獸共患疾病之一，已在世界范圍內(nèi)造成了嚴重的公共衛(wèi)生問題[17-18]。在高原地區(qū)，所有動物均以散養(yǎng)為主，且與人類生活區(qū)域無嚴格的界限，共用水源與食物，使HEV的流行和傳播加劇，同時也更有利于其跨種間傳播[22-23]。盡管已有研究表明HEV是高原一種重要的地方性疾病，但對于其流行率的分析有限，分子水平的遺傳進化分析較少[24]。

本研究藏豬糞便中HEV陽性率為20.48%(68/332，95%CI=16.3%～25.2%)，意大利一項研究表明，豬腹瀉樣本中HEV陽性率顯著高于健康樣本陽性率[26]，與本研究68份陽性糞便中腹瀉樣本HEV陽性率顯著高于健康樣本相契合，表明HEV的流行可能與腹瀉有關。本研究藏豬HEV陽性率為20.48%，顯著高于2018年對四川豬HEV陽性率進行的報道[27]，同時也顯著高于藏豬血清[24]以及膽汁[25]中HEV感染率的調(diào)查，說明在高原地區(qū)藏豬感染HEV的情況相當普遍，且以糞便傳播為主，提示人們要重視高原藏豬HEV的防控及流行情況。

HEV最早被認為只感染人類，引起自限性肝炎，免疫功能低下個體可能發(fā)生慢性HEV感染[29],隨后被證實為人畜共患疾病[10]，HEV-4型為主要的人畜共患基因型，近年來，也有研究證明HEV-4型為我國主要流行基因型，但4型亞型的流行在不同地方也有明顯差異，如我國南部人和豬以HEV-4b亞型為主，而我國東部以HEV-4a亞型為主[30]，本研究中來自四川藏豬的68株HEV均為4型，且主要為4a型，與該研究結果不一致，可能是由于地域差異。已有研究表明人HEV-4毒株的基因組序列與從同一地理區(qū)域獲得的豬HEV-4毒株的基因組序列密切相關[15,31]，而從22個豬場采集的樣本結果顯示主要為4a型，說明該基因型主要由其他地區(qū)傳給藏豬，該病原已在當?shù)夭刎i群中形成流行。為進一步分析其遺傳演化，本研究通過BEAST v1.8.0軟件對87條(其中包括本研究中分別從22個豬場各挑選1株典型毒株的ORF2部分片段)確定采樣時間的HEV ORF2部分片段進行分歧時間的估算結果分析顯示，四川藏豬的HEV4型毒株進化晚于世界各地毒株，說明藏豬HEV可能是由其他地區(qū)豬傳染的，這種現(xiàn)象的形成可能是由于藏豬之間的交配導致豬群之間發(fā)生交叉感染。

HEV的重組事件鮮有報道，但HEV-4a的重組事件卻經(jīng)常出現(xiàn)，并且在病毒進化中發(fā)揮了重要作用，已有研究證明人和豬HEV毒株之間可能發(fā)生重組，存在雙重組事件，在HEV的ORF2區(qū)域內(nèi)可能發(fā)生重組事件[32],另一項研究也表明，病毒在編碼非結構和結構蛋白的基因組連接處重組，創(chuàng)建新的病毒家族，導致人畜共患新型病原的產(chǎn)生(HEV、星狀病毒)[33]。本研究共獲得了3株HEV全基因組，在四川藏豬中鑒定出1株重組HEV-4a毒株：SWU/301/2019。SWU/301/2019重組發(fā)生在ORF1區(qū)域內(nèi)，說明HEV ORF1區(qū)域也有可能發(fā)生重組，產(chǎn)生新的毒株。該重組事件發(fā)生在藏豬和人HEV毒株之間，表明藏豬和人之間傳播HEV的潛在風險。

本研究不僅表明了四川藏豬源HEV是由其他地區(qū)豬傳染給四川地區(qū)藏豬，同時還表明了藏豬源的HEV毒株在不斷進化，毒力有逐漸增強傾向。感染人和動物的HEV 4型毒株為當?shù)刂饕餍卸局昃哂袧撛诘谋┌l(fā)風險，因此應重視HEV的流行，加強對四川藏豬HEV的監(jiān)測。

4 結 論

本研究對采自四川甘孜藏族自治州和阿壩藏族自治州的22個豬場332份藏豬糞便樣本進行HEV檢測；并對全部樣本進行了ORF2分型以及3份典型陽性樣本進行了全基因組序列擴增分析；通過重組分析發(fā)現(xiàn)SWU/301/2019和SWU/31-12/2018有重組現(xiàn)象；遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)藏豬HEV可能是由其他地區(qū)感染豬群傳染的。