飲用天然礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌 檢測遇到的問題及解決辦法

王曉娟 王惠玉

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性桿菌，產(chǎn)芽孢，多以芽胞形式分布于土壤等自然界中，也存在于人、動物及其腸道中，是腸道的正常菌群之一，同時也是一種條件致病菌，能夠引起人類食物中毒和動物壞死性腸炎的食源性疾病?！讹嬘锰烊坏V泉水》（GB 8537-2018）標準對產(chǎn)氣夾膜梭菌的要求是，從一批樣品中采集5件樣品，每件樣品的采樣量是50mL，均不得檢出。《飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538-2016）規(guī)定，飲用天然礦泉水需檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌，將其在亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂（簡稱SPS）培養(yǎng)基上經(jīng)24h、36℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)，計數(shù)濾膜上的黑色菌落，并取黑色可疑菌落做進一步的驗證試驗。但在這一環(huán)節(jié)會遇到一些不確定性因素，如目標菌在特定的時間內未生長、菌落顏色為灰色等，從而影響檢測結果，不能真實反映樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的存在情況。經(jīng)試驗證實，延長培養(yǎng)時間，增加活化的步驟，關注試驗細節(jié)，可以解決試驗中遇到的類似問題。

一、存在的問題

1.在實際檢驗過程中發(fā)現(xiàn)，完全按照GB 8538-2016的方法進行檢驗，濾膜上截留的產(chǎn)氣莢膜梭菌在SPS培養(yǎng)基上經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)24h，并無明顯的黑色菌落，這就容易誤認為被檢樣品中不含產(chǎn)氣莢膜梭菌，而導致漏檢。

2.對確定含有產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品進行檢測后發(fā)現(xiàn)濾膜無黑色菌落產(chǎn)生，只有少量灰色的菌落，再對其進行確證試驗，但生化現(xiàn)象不明顯，最終給出錯誤的實驗結果。

二、解決的方法

將產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株CICC22949接種于血平板上，經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)，待長出明顯菌落，挑取單菌落于液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（簡稱FT），經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)24h，用于后續(xù)試驗。

1.延長培養(yǎng)的時間。根據(jù)GB 8538-2016中的方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌進行檢測試驗，將上述的FT培養(yǎng)液用0.85%的無菌生理鹽水連續(xù)梯度稀釋，配制成濃度分別為10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的菌懸液，分別吸取1mL稀釋后的菌懸液，加入到50mL的無菌天然飲用礦泉水中作為人工污染樣品。將不同濃度的樣品分別過0.22μm的濾膜，將濾膜緊貼于SPS培養(yǎng)基上，經(jīng)36℃厭氧培養(yǎng)24h，不同濃度的菌懸液在SPS培養(yǎng)基上均未發(fā)現(xiàn)有生長跡象。針對該情況，本試驗延長了培養(yǎng)時間，分別在36h、48h、60h、72h進行觀察，結果發(fā)現(xiàn)，在48h后SPS培養(yǎng)基上有菌落生長，但不是標準要求的黑色菌落，而是灰色菌落，菌落數(shù)呈現(xiàn)梯度增長趨勢。

挑取灰色菌落進行確證試驗，結果表明，革蘭氏染色為陽性粗大桿菌，在牛乳培養(yǎng)基中的生長繁殖速度極快，能夠分解乳糖產(chǎn)酸，將酪蛋白凝固，同時產(chǎn)生大量的氣體，沖散酪蛋白，使其呈海綿狀，即“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象，如圖1所示。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌無鞭毛，不運動，硝酸鹽動力試驗無動力（穿刺線周圍沒有擴散），硝酸鹽被還原變?yōu)榧t色，如圖2所示。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，卵黃培養(yǎng)基接種點的底部及周圍有明顯的乳白色渾濁帶，如圖3所示。

2.增加活化的步驟。挑取生長的菌落用FT培養(yǎng)后，再接入FT培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，然后進行確證試驗。試驗中發(fā)現(xiàn)，直接挑取SPS生長的菌落于FT培養(yǎng)基后，確證性試驗結果不明顯，如硝酸鹽動力試驗不明顯，含鐵牛乳培養(yǎng)基“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象不明顯?；诖?，試驗中將FT培養(yǎng)液繼續(xù)接入FT培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再進行確證試驗。結果表明，再次被活化的菌在進行確證試驗時，硝酸鹽動力試驗無動力（不擴散）、硝酸鹽被還原變?yōu)榧t色;含鐵牛乳培養(yǎng)基“暴沸”;卵黃培養(yǎng)基接種點的底部及周圍有明顯的乳白色渾濁帶。

3.易被忽略的問題。配制好的FT培養(yǎng)基在試驗臨用前要隔水煮沸10min，以驅除培養(yǎng)基中溶解的氧氣。這一點往往會被許多實驗者忽略，進而影響到后續(xù)試驗。采用未進行煮沸的FT培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中不易觀察產(chǎn)氣現(xiàn)象;挑取菌落于煮沸后的FT培養(yǎng)基中，會觀察到明顯的氣泡不斷涌出，產(chǎn)氣現(xiàn)象明顯。

三、結論

產(chǎn)氣夾膜梭菌是一種厭氧菌，活力不同對試驗結果會有不同的影響。（1）新購入的標準菌株經(jīng)活化后，在SPS培養(yǎng)基上24h后生長出黑色菌落，且具有較強活力。（2）制成FT培養(yǎng)菌液，在4℃條件下放置2-3d后接種到SPS培養(yǎng)基，24h后無菌落生長;延長培養(yǎng)時間到48h-72h時，SPS平板上可觀察到菌落生長，且顏色為灰色。（3）將放置的FT培養(yǎng)菌液重新接入FT培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，再接種到SPS培養(yǎng)基，24h后生長出黑色菌落。

綜上所述，若產(chǎn)氣夾膜梭菌活力較弱，按標準GB 8538-2016的要求，24h內可能不會生長，會出現(xiàn)假陰性結果。因此，在實際的試驗過程中可以延長產(chǎn)氣夾膜梭菌的培養(yǎng)時間，增加活化的步驟，以此來避免漏檢的可能性。