倪換娟 周維 李廣瑩 曲長(zhǎng)紅 裴麗鵬
(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平院區(qū),遼寧 沈陽(yáng) 110000)
子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,其快速增長(zhǎng)的發(fā)病率引起人們的高度關(guān)注[1]。其在絕經(jīng)前后婦女中是發(fā)病率最高的癌癥[2]。腫瘤細(xì)胞的研究日益受到重視,對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的研究可以深入了解子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制,為臨床治療提供新的方向。
環(huán)狀RNA是一類新的內(nèi)源性非編碼RNA,其特點(diǎn)是其共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)沒(méi)有5′帽或3′ poly A尾[3]。雖然環(huán)狀RNA產(chǎn)生和功能的機(jī)制尚不完全清楚,但最近的研究表明,環(huán)狀RNA可能作為疾病診斷和治療的潛在分子標(biāo)志物,在人類疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,尤其是在腫瘤中[4]。近年來(lái),關(guān)于環(huán)狀RNA在子宮內(nèi)膜癌中的研究有少量報(bào)道。Shen等結(jié)果顯示,circ_0002577通過(guò)調(diào)控miR-197/CTNND1[5]軸及激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展。Liu等[6]報(bào)告稱,circ_0061140通過(guò)調(diào)節(jié)miR-149-5p/STAT3促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展。Zong等[7]的研究指出,circ_PUM1通過(guò)靶向miR-136/NOTCH2通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[7]。還有研究表明,circTNFRSF21通過(guò)調(diào)控miR-1227-MAPK13/ATF2軸促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制[8]。然而,環(huán)狀RNA MYLK對(duì)子宮內(nèi)膜癌的作用還未見報(bào)道。本研究探討子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。
1.1 主要試劑和儀器 HEC-1A細(xì)胞(人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞)購(gòu)自武漢Procell公司;10%胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基、SYBR Green Master Mix購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;GV248 干擾載體購(gòu)自中國(guó)吉?jiǎng)P基因公司;Lipofectamine?2000、Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RNA purification system購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司;DNase-I購(gòu)自瑞士Roche公司;隨機(jī)六聚體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;胰蛋白酶、Giemsa染色液、10 mg/mL RnaseA、碘化丙啶、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、羊抗兔IgG-HRP、1%結(jié)晶紫、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;抗體E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH、Ki67,SignalStain?Boost IHC檢測(cè)試劑、SignalStain DAB Substrate Kit購(gòu)自美國(guó)CST公司。ABI Prism 7000系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司; C6流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;E100光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取20只7周齡清潔級(jí)雄性BALB/c裸小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) :SCXK(京)2018-0002。飼養(yǎng)溫度18~25℃,濕度50%~70%。
1.3 方法
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEC-1A細(xì)胞保存于含10%胎牛血清(FBS),37℃,含5% CO2的濕化培養(yǎng)箱中,Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。
1.3.2 MYLK干擾實(shí)驗(yàn) 選擇三種shRNA:shRNA1、shRNA2、shRNA3用來(lái)干擾circMYLK基因。分為對(duì)照組、shRNA-NC組、circMYLK- shRNA1組、circMYLK-shRNA2組和circMYLK-shRNA3組。circMYLK-shRNAs是針對(duì)circMYLK基因設(shè)計(jì)的(NC_000003.12);采用RT-PCR檢測(cè)干擾效率。將特異性shRNAs克隆到GV248 干擾載體中。綠色熒光蛋白(GFP)慢病毒載體作為陰性對(duì)照。慢病毒通過(guò)Lipofectamine?2000(將慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEC-1A細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后,收集并濃縮含有慢病毒的細(xì)胞上清液,校準(zhǔn)病毒效價(jià)。慢病毒的最終濃度為4×108TU/mL,儲(chǔ)存于-80℃。
1.3.3 異種移植瘤裸鼠模型 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。將轉(zhuǎn)染shRNA-NC和MYLK-shRNA1的HEC-1A細(xì)胞皮下注射至右大腿形成異種移植瘤。將小鼠分為shRNA-NC組和MYLK-shRNA1組,每組各10只。分別于第5、10、15、20、25、30天測(cè)定腫瘤體積。注射后30天測(cè)定腫瘤重量。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(體重200 mg/kg)安樂(lè)死。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)收集腫瘤。所有實(shí)驗(yàn)都是根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則制定的,并且得到了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
1.3.4 RT-qPCR法 總RNA用RNA purification system提取。用DNase-I去除基因組DNA。用Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體從5 mg總RNA中制備cDNA。對(duì)于qRT-PCR,在ABI Prism 7000系統(tǒng)中,使用SYBR Green Master Mix和引物在優(yōu)化濃度下測(cè)定基因表達(dá)。檢測(cè)基因的引物如下:MYLK正向引物 5′- CAGTGCATGCTGTTTGTTCA-3′,反向引物 5′-TCGGAGCCTTGACTTCCAG-3′;內(nèi)參基因GAPDH正向引物5′-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3′ ,反向引物5′-AGGTCCACCACTGACACGTT-3′。每個(gè)基因均生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,擴(kuò)增效率為90%~100%。通過(guò)閾值比較,確定基因表達(dá)的相對(duì)定量。所有結(jié)果均以GAPDH為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化。
1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對(duì)照組、shRNA-NC組及MYLK-shRNA1組的HEC-1A細(xì)胞接種于6孔板中,每孔200個(gè)細(xì)胞,連續(xù)接種7天。廢棄培養(yǎng)基,每個(gè)孔用PBS仔細(xì)洗兩次。將菌落在甲醇中固定20min,然后用Giemsa染色液染色。統(tǒng)計(jì)≥50個(gè)細(xì)胞的菌落數(shù),計(jì)算菌落形成效率:菌落百分比=菌落形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。
1.3.6 流式細(xì)胞術(shù) 用胰蛋白酶消化HEC-1A細(xì)胞,用70%乙醇在4°C下過(guò)夜固定細(xì)胞。然后加入10 mg/mL RnaseA和碘化丙啶于4℃染色過(guò)夜。使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒按照說(shuō)明書使用流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。AnnexinV-FITC(-)/PI(-)(左下)為正常細(xì)胞,AnnexinV-FITC (+)/PI(-)細(xì)胞(右下)為早期凋亡細(xì)胞,AnnexinV-FITC(+)/PI(+)(右上)為晚期凋亡細(xì)胞。AnnexinV(-)/PI(+)(左上)為壞死細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
1.3.7 Transwell實(shí)驗(yàn) HEC-1A細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理后,接種于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,細(xì)胞數(shù)為3×104個(gè)/孔。培養(yǎng)24小時(shí)后,用棉簽將上層殘留的細(xì)胞取出。遷移后的細(xì)胞在室溫下用95%乙醇固定,然后用1%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察每個(gè)孔的五個(gè)隨機(jī)區(qū)域的染色情況。
1.3.8 Western Blot法 用10% SDS-PAGE分離細(xì)胞和腫瘤中的蛋白,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在被5%脫脂牛奶封閉后,蛋白質(zhì)與第一抗體在4℃下孵育過(guò)夜。主要抗體如下:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH。PBS洗滌,羊抗兔IgG-HRP(索萊寶)孵育1h。用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒觀察這些條帶。
1.3.9 免疫組化法 脫蠟、復(fù)水、修復(fù)后,用5%正常山羊血清封閉石蠟切片1h,與抗體共培養(yǎng)過(guò)夜:Ki67和Vimentin。切片用TBST沖洗,與SignalStain?Boost IHC檢測(cè)試劑室溫下孵育30分鐘。切片用SignalStain DAB Substrate Kit染色,在E100光學(xué)顯微鏡下觀察。
2.1 shRNAs抑制circMYLK表達(dá)的干擾效率檢測(cè) 設(shè)計(jì)circMYLK-shRNA1、circMYLK-shRNA2和circMYLK-shRNA3分別轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞,RT-qPCR檢測(cè)干擾效率。與對(duì)照組(0.99±0.06)比較,circMYLK-shRNA1組 (0.08±0.05)、circMYLK-shRNA2組 (0.48±0.08)和circMYLK-shRNA3 組(0.30±0.07)的MYLK表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05),其中circMYLK-shRNA1組干擾效果最佳,因此選用shRNA1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見圖1。
圖1 shRNAs抑制circMYLK表達(dá)的干擾效率檢測(cè)(n=3)
2.2 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞克隆形成的影響 與對(duì)照組(48.8±11.2)比較,circMYLK-shRNA1組(11.46±5.89)的克隆形成率顯著降低(P<0.05)??梢?,干擾MYLK能抑制HEC-1A細(xì)胞的克隆形成,見圖2。
圖2 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞克隆形成的影響
2.3 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組(5.16±2.92)比較,circMYLK-shRNA1組(29.44±6.22)的細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)??梢?,干擾MYLK能促進(jìn)HEC-1A細(xì)胞的凋亡,見圖3。
圖3 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞凋亡的影響
2.4 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組(48.25±6.67)比較,circMYLK-shRNA1組(18.88±8.11)的侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。可見,干擾MYLK能抑制HEC-1A細(xì)胞的侵襲,見圖4。
圖4 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞侵襲的影響
2.5 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響 與對(duì)照組比較,circMYLK-shRNA1組的E-cadherin (0.028±0.013 vs 0.134±0.048)表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),而N-cadherin (0.824±0.078 vs 0.040±0.018)和Vimentin (0.544±0.07 vs 0.063±0.037)表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。表明干擾MYLK能抑制HEC-1A細(xì)胞的EMT,見圖5。
圖5 MYLK干擾對(duì)HEC-1A細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響
2.6 MYLK干擾對(duì)裸鼠模型移植瘤的影響 轉(zhuǎn)染shRNA-NC或circMYLK-shRNA1的HEC-1A細(xì)胞皮下注射裸鼠建立移植瘤裸鼠模型。注射30d后,與shRNA-NC組比較,circMYLK-shRNA1組的腫瘤體積和腫瘤重量(0.40±0.08 vs 0.15±0.07)均顯著降低(P<0.05)(見圖6A、B、C)。與shRNA-NC組比較,circMYLK-shRNA1組的MYLK表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)(見圖6D)。與shRNA-NC組比較,circMYLK-shRNA1組增殖相關(guān)的Ki67 (58.42±8.93 vs 14.79±7.17)和侵襲相關(guān)的Vimentin (65.91±9.88 vs 18.69±5.98)表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)(見圖6E、F)??梢?,干擾MYLK能抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)和EMT。
圖6 MYLK干擾對(duì)裸鼠模型移植瘤的影響
子宮內(nèi)膜癌是女性常見的生殖系統(tǒng)癌癥[2]。轉(zhuǎn)移前腹腔鏡與開腹手術(shù)治可能是比較有效的診斷和治療手段[9],且腹腔鏡子宮內(nèi)膜癌根治術(shù)可能是較優(yōu)的選擇[10]。然而轉(zhuǎn)移一旦方發(fā)生,治療難度將大大增加。因此,探索轉(zhuǎn)移的機(jī)制,以便開發(fā)更多抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的藥物,對(duì)于子宮內(nèi)膜癌治療很重要。
非編碼RNA已被廣泛證明參與生理、病理和疾病治療過(guò)程[11]。如在子宮內(nèi)膜癌中,長(zhǎng)鏈非編碼RNA-C00473高表達(dá)于腫瘤組織,可能通過(guò)cyclin D1途徑促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力[12]。環(huán)狀RNA是閉合環(huán)狀的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,主要由蛋白質(zhì)編碼基因的外顯子產(chǎn)生。由于不含5′或3′端,在許多情況下,比線性產(chǎn)物更為豐富。某些環(huán)狀RNA非分裂細(xì)胞中非常豐富,許多也表現(xiàn)出生理特異性和組織特異性的表達(dá)[13]。大量重要的研究文章指出了癌癥和某些環(huán)狀RNA之間的關(guān)系。MYLK是最近表征的促癌基因。MYLK可能是VEGF的重要調(diào)控基因。在膀胱癌中,MYLK可能作為miR-29a的內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA,激活VEGFA信號(hào)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14]。為了考察MYLK在子宮內(nèi)膜癌中的作用,在本研究中干擾MYLK表達(dá)。與此前研究一致,我們發(fā)現(xiàn),MYLK在子宮內(nèi)膜癌中也扮演著促癌基因的角色。
腫瘤的惡性程度與相關(guān)蛋白的表達(dá)關(guān)系密切,其中Ki67是與細(xì)胞分裂有關(guān)的蛋白抗原,Ki67的表達(dá)量與細(xì)胞增殖能力呈正比[15]。而細(xì)胞凋亡(Apoptosis)在胚胎發(fā)育、系統(tǒng)功能完善、機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面起重要作用。當(dāng)細(xì)胞凋亡功能受到抑制時(shí),將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及免疫功能的異常[16]。此外,上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性中同樣扮演重要角色[17]。在EMT過(guò)程中上皮細(xì)胞改變其形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)而失去上皮細(xì)胞特征,并獲得侵襲性和遷移性間充質(zhì)表型,參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,尤其在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲中發(fā)揮著重要作用[18]。其中E-鈣黏蛋白(E-cadherin, E-cad)、波形蛋白(Vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin, N-cad)等是EMT的重要標(biāo)志物[19]。此外,經(jīng)歷EMT的細(xì)胞表現(xiàn)出與腫瘤干細(xì)胞(CSCs)相似的特征,如藥物外排泵的增加和抗凋亡作用[20]。
MYLK可能是通過(guò)對(duì)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控實(shí)現(xiàn)促癌作用的。位于3q21上的MYLK基因通過(guò)三個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子編碼三種蛋白質(zhì)(非肌肉肌球蛋白輕鏈激酶即nmMLCK,平滑肌MLCK和telokin。nmMLCK調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架重排和收縮,驅(qū)動(dòng)肌動(dòng)蛋白單體組裝成聚合物或應(yīng)力纖維,并進(jìn)一步發(fā)出信號(hào)表明肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維收縮[21]。這一過(guò)程對(duì)于癌細(xì)胞增殖和遷移的細(xì)胞骨架的快速動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)至關(guān)重要[22]。VEGF信號(hào)通路的激活在mRNA和蛋白水平上增加了MYLK基因產(chǎn)物,而MYLK則通過(guò)注入調(diào)控miR-513a-5p之類的VEGF抑制MiRNA,促進(jìn)VEGF的高表達(dá)[23]。因此,VEGF與MYLK可能構(gòu)成了一個(gè)促進(jìn)腫瘤增殖遷移的正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。在膀胱癌中上調(diào)MYLK可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),而敲減MLYK則會(huì)抑制細(xì)胞增殖、活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。有結(jié)果顯示,MLYK促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,干擾MYLK明顯加速了細(xì)胞凋亡[24]。Lin等[25]指出,MYLK敲減明顯抑制了肝癌細(xì)胞的創(chuàng)面愈合能力和遷移入侵的能力,進(jìn)而阻礙了肝癌細(xì)胞的EMT。Zhao等[26]研究揭示,沉默MYLK后卵巢癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱。在本研究中,我們的結(jié)果表明,干擾MYLK促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞凋亡,并抑制了細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT,進(jìn)而阻礙體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。
本研究結(jié)果提示,MYLK可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞增殖、侵襲及EMT,并阻礙凋亡,MYLK沉默逆轉(zhuǎn)了上述腫瘤惡性生物學(xué)行為,并且抑制了裸鼠模型異種移植瘤的生長(zhǎng)。