王麗 朱九群 龍超 何林 董文娟

(1.南充市中心醫(yī)院藥學(xué)部·個體化藥物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000； 2.四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，四川 成都 610072；3.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都610072)

惡性黑色素瘤是黑色素細(xì)胞惡變而來的腫瘤，惡性程度高。黑色素瘤發(fā)現(xiàn)越早，治愈可能性越大，預(yù)后越好。90%～95%早期惡性黑色素瘤可以經(jīng)外科手術(shù)治愈，中、晚期手術(shù)治療效果較差，一般建議以內(nèi)科治療為主的全身系統(tǒng)治療[1]。

美國FDA 1975年將達(dá)卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)批準(zhǔn)用于惡黑的化療[2-6]。長期以來是黑色素瘤化療的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但DTIC在臨床使用中存在穩(wěn)定性差，患者順應(yīng)性低，不良反應(yīng)嚴(yán)重，對腦轉(zhuǎn)移無效等缺陷[9-10]。

脂質(zhì)體(liposome,LP)目前已成為一種有效的藥物遞送系統(tǒng)。相比普通劑型，脂質(zhì)體能改善藥物的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)并降低藥物的毒副作用[11-13]。但普通脂質(zhì)體易被血管和肝脾吞噬細(xì)胞迅速吞噬，用聚乙二醇對脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾可屏蔽機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對脂質(zhì)體的識別，延遲肝脾清除，使藥物體內(nèi)循環(huán)時間延長，被稱為隱形脂質(zhì)體(Stealth liposome,SL)，又稱為長循環(huán)脂質(zhì)體(long circulating liposome,LCL)[14-18]，還可通過EPR效應(yīng)自發(fā)往腫瘤中聚集，發(fā)揮靶向作用[19-20]。本文擬制備PEG修飾的DTIC長循環(huán)脂質(zhì)體(PEG-DTIC-LP)，對其體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 一般材料 N-1200A旋蒸儀購自東京理化器械株式會社；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞破碎機(jī)購自寧波新芝生物科技公司；Universal 320R離心機(jī)購自德國Hettich公司； Malvern Zetasizer Nano ZS90納米激光粒度儀購自英國Malvern公司；透射電鏡購自美國FEI公司；DTIC購自蘇州立新制藥有限公司；大豆卵磷脂、膽固醇、硫酸銨購自成都科龍化工試劑廠；DSPE-PEG2000購自上海RVT醫(yī)藥科技公司；B16-F10細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫。健康SPF級C57BL/6小鼠，六周齡，體重18～22g，雌雄各半，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SYXK(川)2013-110。本試驗(yàn)動物的處理符合動物倫理要求，并經(jīng)南充市中心醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 方法

1.2.1 PEG-DTIC-LP的制備及性質(zhì)表征 采用硫酸銨梯度法制備PEG-DTIC-LP[21]。按70∶5∶25摩爾比稱取大豆卵磷脂、DSPE-PEG2000、膽固醇裝入圓底燒瓶，用適量三氯甲烷充分溶解，于旋蒸儀上旋蒸去掉有機(jī)溶劑后在瓶底形成無色透明薄膜，加入0.3 mol/L硫酸銨溶液適量，繼續(xù)旋蒸形成乳白色混懸液，用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)超聲5 min即制得空白脂質(zhì)體。將空白脂質(zhì)體裝于透析袋中，用5% GS溶液透析8 h，每小時換一次透析液。透析完成后將處方量DTIC加入空白脂質(zhì)體，40 ℃孵育20 min，即得1mg/mL的PEG-DTIC-LP混懸液。

1.2.1.1 包封率和載藥量 將PEG-DTIC-LP置于超濾離心管中離心可得游離DTIC溶液，采用紫外分光光度法測定DTIC濃度，按公式1和公式2計(jì)算包封率和載藥量。

(公式1)

(公式2)

1.2.1.2 外觀和形態(tài) 肉眼觀察PEG-DTIC-LP混懸液的質(zhì)地、顏色；采用負(fù)染法處理樣品，用透射電鏡觀察其微觀形態(tài)。

1.2.1.3 粒徑分布和Zeta電位 采用Malvern Zetasizer Nano ZS90粒度儀測定PEG-DTIC-LP的粒徑、分布及Zeta電位。

1.2.1.4 穩(wěn)定性考察 將新制備的PEG-DTIC-LP混懸液放置于4℃冰箱冷藏，觀察其外觀變化并逐周測定包封率，考察其載藥穩(wěn)定性。

1.2.1.5 體外釋藥性 取1 mL PEG-DTIC-LP混懸液于MW3500透析袋中，放置于50 mL 10mmol/L的 PBS 6.5和PBS 7.4透析液中，設(shè)置37℃恒溫?fù)u床100 r/min持續(xù)振搖。分別于時間點(diǎn)1、2、4、8、12、24小時吸取透析液500 μL測定DTIC濃度，每次取液后需補(bǔ)充500 μL對應(yīng)空白透析液。最后一個時間點(diǎn)取完后將透析袋中的PEG-DTIC-LP混懸液倒入釋放介質(zhì)中，并加入10%Triton X-100溶液50 μL，吸取該混合溶液500 μL測定DTIC濃度。DTIC濃度的測定采用紫外-可見分光光度法，按公式3計(jì)算藥物累積釋放率，繪制體外累積釋藥曲線圖[22-23]。

(公式3)

1.2.2 PEG-DTIC-LP體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)研究 將對數(shù)生長期B16-F10細(xì)胞用無菌生理鹽水配制成2×106個/ mL的細(xì)胞懸液，于C57BL/6小鼠背部皮下注射0.2 mL B16-F10細(xì)胞懸液，精心飼養(yǎng)小鼠10天，篩選腫瘤生長良好的小鼠作為荷黑色素瘤小鼠模型。選出24只腫瘤大小及體重相近(23±2.5g)的荷瘤小鼠，分為生理鹽水組、空白脂質(zhì)體組、DTIC溶液組、PEG-DTIC-LP組4組，每組6只，雌雄各半。于第1、3、5、7、9天按10 mg/kg給藥劑量給生理鹽水組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，空白脂質(zhì)體組尾靜脈注射空白脂質(zhì)體混懸液，DTIC溶液組尾靜脈注射1mg/mL DTIC溶液，PEG-DTIC-LP組尾靜脈注射1 mg/mL PEG-DTIC-LP混懸液。以腫瘤體積、小鼠體重、小鼠存活天數(shù)為指標(biāo)，評價(jià)PEG-DTIC-LP的抗腫瘤效應(yīng)，并與其余各組進(jìn)行比較。從治療第一天開始隔天一次測量小鼠腫瘤體積和小鼠體重。從腫瘤細(xì)胞接種日期(day 0)算起，統(tǒng)計(jì)小鼠存活天數(shù)，繪制各組小鼠的生存曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 PEG-DTIC-LP性質(zhì)表征

2.1.1 包封率和載藥量 硫酸銨梯度法制備的PEG-DTIC-LP包封率為(60.41±2.47)%，載藥量為(5.95±0.24)%。

2.1.2 外觀及形態(tài) 肉眼觀察下PEG-DTIC-LP混懸液呈質(zhì)地均勻、半透明、有亮藍(lán)光澤的乳白液體。在透射電鏡下呈球形，外觀圓整，見圖1。

圖1 PEG-DTIC-LP透射電鏡圖

2.1.3 粒徑分布及Zeta電位 Malvern Zetasizer Nano ZS90粒度儀測得PEG-DTIC-LP的粒徑呈近似正態(tài)分布，平均粒徑為190nm，多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)為0.184，Zeta電位-53.8 mV，見圖2。

圖2 PEG-DTIC-LP粒徑分布直方圖

2.1.4 穩(wěn)定性考察 4℃條件下，7天內(nèi)PEG-DTIC-LP混懸液的外觀無明顯變化；放置14天后，亮藍(lán)色乳光消失。28天包封率變化為：0天(60.41±2.47)%、7天(59.15±0.98)%、14天(55.66±0.69)%、21天(51.03±2.09)%、28天(33.10±0.29)%，可見放置7天后PEG-DTIC-LP包封率無顯著變化(P>0.05)，由60.41%下降為59.15%，放置14天后包封率下降為(55.66±0.69)%(P<0.05)。

2.1.5 體外釋放研究 PEG-DTIC-LP在PBS 6.5和PBS 7.4中的藥物累積釋放曲線，PEG-DTIC-LP在兩種釋放介質(zhì)中均呈現(xiàn)一定緩釋特性，在弱酸性環(huán)境PBS6.5中呈現(xiàn)出更高的藥物釋放率，見圖3。

圖3 達(dá)卡巴嗪長循環(huán)脂質(zhì)體體外釋藥曲線圖

2.2 PEG-DTIC-LP體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)

2.2.1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積變化比較 給藥后第18天，PEG-DTIC-LP組小鼠腫瘤體積為(696.63±536.82)mm3，顯著小于DTIC溶液組(5128.93±1120.49)mm3和生理鹽水組(3174.46±1160.98) mm3(P<0.05)，小于空白脂質(zhì)體組(1771.39±909.04 )mm3，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖4 荷瘤小鼠腫瘤體積變化

2.2.2 各組荷瘤小鼠給藥后體重變化 空白脂質(zhì)體組、生理鹽水組和DTIC溶液組的荷瘤小鼠給藥后體重變化曲線基本重合，三組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PEG-DTIC-LP組荷瘤小鼠平均體重低于其余三組(P<0.05)，原因可能是該組小鼠給藥后黑色素瘤生長速度顯著減小，使瘤體重量小于其余各組，見圖5。

圖5 荷瘤小鼠體重變化

2.2.3 荷瘤小鼠生存時間 各組荷瘤小鼠中位生存時間長短分別為：PEG-DTIC-LP組為35天，DTIC溶液組為26天，空白脂質(zhì)體組為31天，生理鹽水組為29天，即PEG-DTIC-LP組>空白脂質(zhì)體組>生理鹽水組>DTIC溶液組(P<0.05)，見圖6。

圖6 荷瘤小鼠生存曲線圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)制備的PEG-DTIC-LP平均粒徑為190nm，研究表明[24]粒徑小于200nm，有利于脂質(zhì)體進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，滲透進(jìn)入病灶組織發(fā)揮藥效。

體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PEG-DTIC-LP組荷瘤小鼠給藥后腫瘤體積最小，中位生存時間最長，初步證明PEG-DTIC-LP療效顯著優(yōu)于DTIC溶液。但令人意外的是，相比生理鹽水和空白脂質(zhì)體兩個空白對照組，DTIC溶液組小鼠中位生存時間最短，腫瘤體積最大，造成該結(jié)果原因可能有三點(diǎn)：①小鼠樣本量偏少。本來實(shí)驗(yàn)最初預(yù)定的是每組10只小鼠，由于構(gòu)建黑色素腫瘤模型過程中，部分小鼠建模失敗和死亡，最終篩選出建模成功、體重和腫瘤大小接近的荷瘤小鼠24只，每組6只，造成實(shí)驗(yàn)樣本量小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差偏倚較大，這是本實(shí)驗(yàn)的遺憾和不足。②普通DTIC制劑自身有效率偏低，1998-2006年4個Ⅲ期多中心隨機(jī)對照研究顯示DTIC單藥有效率僅為7.5%～12.2%[25]。③DTIC游離藥物細(xì)胞毒作用強(qiáng)，使小鼠給藥后存活時間較短。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，將DTIC制備成長循環(huán)脂質(zhì)體有利于提高其抗腫瘤效應(yīng)。