李浩霞 尹躍 楊斌 安巍 趙建華

摘要：以寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）'寧杞1號'果實為材料，利用RT-PCR技術(shù)，克隆出LbPME的全長序列為1 152 bp，包含完整的開放閱讀框（ORF），編碼有384個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為42.63 ku，理論等電點9.20;LbPME編碼的蛋白包含2個可能的N-糖基化結(jié)合位點（Asn46和Asn183），4個底物結(jié)合位點（Thr166、Gln201、Arg301和Trp303）和2個酶活性位點（Asp224和Asp245）。分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白由多個呈右手螺旋的β折疊肽鏈組成，且含有1個中空三角柱狀的PME經(jīng)典結(jié)構(gòu);LbPME與茄科的煙草的同源性達到90.86%。利用實時熒光定量技術(shù)，發(fā)現(xiàn)不同組織中LbPME均有表達，且在莖中最高而葉中最低，兩者存在顯著差異;隨著果實的發(fā)育，LbPME表達量呈現(xiàn)出先升后降趨勢，在青果期表達量最高，隨后顯著降低，在成熟期維持較低水平。本研究結(jié)果為進一步探討枸杞LbPME的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：枸杞;果膠酯酶基因;克隆;表達

中圖分類號： S188? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0033-06

收稿日期：2021-01-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：32060359）;寧夏自治區(qū)科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項目（編號：KJT2017004）;寧夏自治區(qū)農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新專項（編號：NKYJ-18-16）。

作者簡介：李浩霞（1977―），女，甘肅景泰人，副研究員，主要從事旱作農(nóng)業(yè)及栽培生理研究。E-mail：lihaoxia0943@163.com。

通信作者：趙建華，博士，副研究員，主要從事枸杞種質(zhì)遺傳改良與分子生物學研究。E-mail：zhaojianhua0943@163.com。

果膠酯酶又稱果膠甲酯酶（pectin methylesterase，簡稱PME），是細胞壁代謝的關(guān)鍵酶之一，PME催化果膠分子去甲酯化后易與鈣離子結(jié)合，使細胞壁硬化，延緩細胞的生長;同時，PME在去甲酯化過程中，釋放大量氫離子，形成低pH值的胞外環(huán)境，聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶活性增強，造成果膠大量降解，促進細胞加快生長[1-2]。在柑橘、香蕉、蘋果、葡萄、胡蘿卜、番茄、馬鈴薯、豌豆等植物中均有關(guān)于PME的報道[3]。擬南芥PME基因僅在花粉中特異表達，缺失該基因會造成花粉管形態(tài)異常及種子數(shù)減少[4]，而擬南芥PME基因的表達受丁香假單胞桿菌番茄致病變種的誘導，當植株受到病菌侵染時，該基因表達量大幅上升[5]。豌豆根尖PME基因的表達與根邊緣細胞的游離緊密相關(guān)，該基因表達會抑制根邊緣細胞的正常游離[6]。休眠狀態(tài)的黃杉種子未檢測到PME的活性，但逐漸增加外源PME濃度，會引起種子休眠的破壞和萌發(fā)[7]。隨著櫻桃的果實果肉的軟化，PME活性逐漸增高[8]。此外，通過QTL分析篩選出3個果膠酯酶參與番茄果實抗壞血酸含量的調(diào)控[9]。在轉(zhuǎn)CbPMEI1和PMEI13基因擬南芥中，PME參與低溫和鹽脅迫下根系生長調(diào)控[10]。因此，PME在植物生長發(fā)育、種子萌發(fā)和果實軟化等過程中發(fā)揮著重要作用[11]。

PME廣泛存在于高等植物中，目前已從柑橘[12]、棉花[13]、草莓[14]、番茄[15]、枇杷[16]等中分離出PME基因。擬南芥PME基因在花和莢果整個發(fā)育階段均有不同程度的表達[17]。研究發(fā)現(xiàn)，PME基因大多以基因家族的形式存在[18-19]，水稻有59個編碼基因，擬南芥有66個編碼基因，白楊有89個編碼基因[20-22]，但目前有關(guān)于枸杞PME的研究國內(nèi)還尚未見到報道，本研究以寧夏枸杞'寧杞1號果實為材料，基于枸杞果實轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，克隆出枸杞果實中LbPME的 cDNA 全長，并分析枸杞果實發(fā)育各個時期LbPME的表達特征，為進一步研究枸杞LbPME基因的功能及枸杞生長代謝機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為寧夏枸杞'寧杞1號'品種，均采自寧夏銀川市西夏區(qū)蘆花臺園林場國家枸杞種質(zhì)資源圃（106°9′ E、38°380′ N，海拔1 100 m），選取6年生'寧杞1號'樹3棵，于2018年6―7月，在果實發(fā)育的幼果期（開花后約9 d）、青果期（開花后約15 d）、色變期（開花后約22 d）、初熟期（開花后約29 d）和成熟期（開花后約36 d），分別選取果粒大小均勻、果色一致的無病蟲害的果實;在果實成熟期采集枸杞根、莖、葉和果實，所用材料用液氮迅速凍結(jié)后，運送回國家枸杞工程中心分子生物學實驗室后立即放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol 試劑盒（北京TIANGEN公司）提取枸杞果實的總RNA，利用RT-PCR試劑盒（美國ThermoFisher公司）對提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈cDNA，用于后續(xù)LbPME的克隆及表達分析。

1.2.2 目的基因克隆 依據(jù)轉(zhuǎn)錄組所獲得的EST序列，設(shè)計全長引物：LbPME-F和LbPME-R（表1）。以枸杞果實反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，擴增目的基因LbPME的全長序列。PCR反應體系：2×PCR Buffer 25 μL，dNTP （2 mmol/L） 10 μL，LbPME-F （10 μmol/L） 2 μL，LbPME-R （10 μmol/L） 2 μL，cDNA 模板1 μL，KOD FX Neo（1 U/μL，Toyobo Life Science Cat）1 μL，Millipore H2O補足50 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性5 min;98 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共30個循環(huán);68 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體（德國TakaRa公司）上進行測序。

1.2.3 實時熒光定量表達分析 根據(jù)LbPME序列設(shè)計熒光定量引物LbPME-qRTF和LbPME-qRTR（表1），以18S基因為內(nèi)參基因，在BIO-RAD CFX ConnectTM 熒光定量 PCR 儀中進行擴增。反應體系：Power SYBR Green PCR Master Mix （Applied Biosystems Cat）12.5 μL，LbPME-qRTF（10 μmol/L）1 μL，LbPME-qRTR（10 μmol/L） 1 μL， cDNA模板5 μL， Millipore H2O補足25 μL。內(nèi)參基因18S使用的實時熒光定量PCR引物為 18S-F2 和18S-R2。反應條件：95.0 ℃預變性 3 min;循環(huán)為95.0 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸20 s，75 ℃讀板5 s，共40個循環(huán);溶解曲線從65 ℃上升到95 ℃， 每次讀板上升0.5 ℃。通過計算2-ΔΔCT值來確定該基因的相對表達量。

1.2.4 生物信息學分析 利用DNAman軟件對LbPME全長進行相應氨基酸序列分析;利用ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）完成蛋白基本性質(zhì)分析;采用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）完成亞細胞定位分析;使用NCBI Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）對序列的結(jié)構(gòu)域和功能進行分析;使用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org）進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測分析;在NCBI網(wǎng)站運行的Blast程序數(shù)據(jù)庫中對LbPME氨基酸序列進行相似性搜索，并進行了聚類分析;利用MEGA7軟件中提供的比對功能進行多序列比對并基于鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹bootstrap系數(shù)為1 000次，進化距離計算采用泊松校正方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞LbPME基因克隆分析

基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)TR12421|c0_g1的EST基因在果實發(fā)育過程中FRKM值呈現(xiàn)出顯著差異。以該EST序列設(shè)計特異性異物，從枸杞果實中獲得枸杞果膠酯酶基因片段（圖1）。該片段測序長度為1 152 bp（圖2）。經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，該序列與果膠酯酶同源，暫時命名為LbPME，NCBI注冊號為KX584484。

2.2 枸杞LbPME基因氨基酸序列及進化樹分析

測序結(jié)果如圖2所示。該基因含有1個1 152 bp 的開放閱讀框，編碼有384個氨基酸，其理論等電點和分子量分別為9.20和42.63 ku，該基因的氨基酸序列分子式為C1 957H2 954N512O533S14，包含25個堿性氨基酸（Asp+Glu）和36個酸性氨基酸（Arg+Lys）。消光系數(shù)為58 370，吸光系數(shù)為1.369。脂肪酸系數(shù)為77.68，不穩(wěn)定系數(shù)為28.40，是一個較穩(wěn)定的蛋白。

對其結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果表明，該蛋白在Ser37～Ile381位氨基酸序列與果膠酯酶結(jié)構(gòu)域（PLN02682）有較高相似性，其E值為0e+00。由圖3可見，該蛋白具有果膠酯酶的顯著特征，在LbPME蛋白序列中發(fā)現(xiàn)有2個可能的N-糖基化結(jié)合位點（Asn46和Asn183），4個底物結(jié)合位點，分別是Thr166、Gln201、Arg301和Trp303，2個酶活性位點Asp224和Asp245，以及1個疑似的過渡態(tài)穩(wěn)

定位點Gln223（未在圖上標示）。對其進行三級結(jié)構(gòu)預測，LbPME由多個β折疊呈現(xiàn)右手螺旋排列，形成中空的三角形柱狀果膠酯酶經(jīng)典結(jié)構(gòu)，其中一側(cè)為底物結(jié)合與催化位點。無規(guī)卷曲形成了4個底物結(jié)合位點（Thr166、Gln201、Arg301和Trp303），這4個位點形成一個四邊形結(jié)構(gòu)。

采用PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）對LbPME蛋白進行亞細胞定位，結(jié)果表明，該酶有可能是一種分泌在細胞外蛋白，并結(jié)合到細胞壁上發(fā)揮其功能。利用Blast比對分析，LbPME與茄科的同源性最高，與煙草的同源性達到90.86%。利用MEGA7軟件，構(gòu)建果膠酯酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），枸杞LbPME與茄目物種煙草、辣椒、馬鈴薯、牽?；ň垲惖揭粋€分枝，并與真子葉菊分支的其他2個目（唇形目和菊目）果膠酯酶聚類到一個大分枝上;但與真子葉薔薇分支物種的果膠酯酶完全分離。此外，薔薇分支物種櫻桃與桑樹完全聚類到不同的2個分枝中;但親緣關(guān)系較遠的金虎尾目胡楊與無患子目柑橘卻聚到一起。這也說明果膠酯酶在植物進化過程中既具有很好的保守性，又在物種間呈現(xiàn)出少量變異。

2.3 枸杞LbPME基因表達特征分析

通過qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，枸杞植株根、莖、葉、果實等組織器官中的LbPME均有表達，其中，莖中表達量最高，果實中次之，葉中最低，且莖中表達量顯著高于其他3個組織器官（圖5-A）。隨著枸杞果實發(fā)育，果實中LbPME呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢（圖5-B），在青果期表達量達到最大， 隨后顯著降低，在果實成熟時表達量維持較低水平。在果實發(fā)育的幼果期和成熟期枸杞LbPME表達量較低，且2個發(fā)育期表達量無顯著差異，但顯著低于其他3個時期，可見，枸杞LbPME在果實發(fā)育青果期到初熟期表現(xiàn)得更為活躍，但在果實成熟時可能由于細胞壁發(fā)育趨于穩(wěn)定，LbPME表達量降低。

3 結(jié)論與討論

自Balestrierii等從獼猴桃克隆出第1個PME基因后[23]，對植物PME基因的研究愈加深入。 植物天然PME分子量一般在15～36 ku[9]，如胡蘿卜34.5 ku[24]，大豆33 ku[25]，臍橙36.2 ku[26]。在本研究中，成功克隆出枸杞LbPME全長為1 152 bp，包含1個完整的開放閱讀框（ORF），編碼383個氨基酸，其理論等電點和分子量分別為9.20和42.63 ku。而在枇杷中分離出2個EjPPME1和EjPPME2基因，均包含1個1 737 bp的開放閱讀框（ORF），共編碼578個氨基酸，EjPPME1理論等電點為8.94，理論分子量為63.05 ku，EjPPME2理論等電點為9.04，理論分子量為63.12 ku[16]。可見，不同植物PME蛋白分子存在一定差異，這可能是PME基因大多以基因家族的形式存在的緣故[18-19]。進一步對枸杞LbPME蛋白的三級結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有PME的顯著特征，由多個呈右手螺旋的β折疊的肽鏈排列而成，并且形成中空三角柱狀的PME經(jīng)典結(jié)構(gòu)，這與胡蘿卜、番茄的PME三維結(jié)構(gòu)基本相似[27-28]。

PME是細胞壁代謝的關(guān)鍵酶之一，主要作用是催化植物細胞壁中的果膠去甲酯化，生成果膠酸和甲醇，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育。PME廣泛存在于高等植物中，其表達存在時空差異特性，一些PME基因在整個植株的生命周期能持續(xù)表達[29]。但也有一些PME基因只在植株生長發(fā)育的特定階段或特定的組織器官中表達。在草莓上發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)aPE1僅在果實中表達，F(xiàn)aPE2僅在葉中表達，F(xiàn)aPE3-4在整個植株中均有表達[15]。在本研究中，LbPME在整個植株均有表達，其中，在莖中的表達量最高，在葉中的表達量最低。隨著果實不斷發(fā)育，果實中LbPME表達量呈現(xiàn)出先升后降變化趨勢，在整個發(fā)育階段青果期表達量最高，幼果期最低，這與草莓果實發(fā)育過程中PME基因變化趨勢基本一致。這就表明LbPME在枸杞果實發(fā)育的青果期發(fā)揮重要作用，但隨著果實不斷發(fā)育，LbPME的表達量逐漸降低，在果實成熟時維持著較低表達水平，其參與枸杞果實細胞壁成熟表達水平明顯減弱，但LbPME在果實發(fā)育過程中參與果實細胞壁合成調(diào)控還有待于進一步研究。

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