程欣

摘要：為了解番茄OFP基因家族的功能特征，通過生物信息學(xué)手段對番茄OFP基因家族成員進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，包括染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三維構(gòu)象、啟動子分析、親緣關(guān)系及組織特異性分析。結(jié)果表明，番茄中的31個OFP基因在12條染色體上呈不均勻分布;除SlOFP6、SlOFP7、SlOFP12、SlOFP13基因以外，其余27個OFP基因均不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，大部分OFP蛋白為不穩(wěn)定性蛋白，并且54.8%的OFP蛋白分布于細(xì)胞核中。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象顯示，番茄OFP蛋白以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要組成成分，表明番茄OFP蛋白之間存在保守性。啟動子順式作用元件分析結(jié)果表明，番茄OFP基因啟動子上主要存在3類元件：光響應(yīng)、激素響應(yīng)應(yīng)答以及逆境脅迫響應(yīng)元件。而組織特異性分析結(jié)果表明，番茄OFP基因在各組織中的表達(dá)量差異較大，預(yù)示著番茄OFP基因生物學(xué)功能的多樣性。分析結(jié)果將為后續(xù)研究番茄OFP基因家族成員的生物學(xué)功能提供參考。

關(guān)鍵詞：番茄（Solanum lycopersicum）;OFP基因家族;生物信息學(xué)分析;蛋白質(zhì)理化性質(zhì);蛋白結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S641.201;Q78 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0039-09

收稿日期：2021-01-29

基金項目：重慶市科委自然科學(xué)基金（編號：cstc2018jcyjAX0458）。

作者簡介：程 欣（1996—），女，四川廣安人，碩士研究生，主要從事番茄功能基因的克隆與應(yīng)用研究。E-mail：chengxin599@163.com。

番茄（Solanum lycopersicum）原產(chǎn)于南美洲，是管狀花目茄科番茄屬的一種一年生或多年生草本植物，是兼具營養(yǎng)價值和商業(yè)價值的一種蔬菜作物，是植物分子生物研究的一種模式植物。番茄富含大量維生素C、番茄紅素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，具有抗癌防衰、提高人體免疫力的功效，因此受到越來越多人的青睞。番茄果實為多汁漿果，有圓球形、高圓形、扁圓形、卵圓形、方圓形、梨形等多種果形。研究表明，OVATE是第一個被鑒定為控制番茄果實形狀的主要定量性狀基因座（QTL）[1]。

OFP基因家族編碼OFP蛋白（OVATE family proteins）。OFP蛋白是僅存在植物中的一類轉(zhuǎn)錄抑制因子，其C末端包含一個約70個氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域，被稱為OVATE結(jié)構(gòu)域[2-5]。雖然OFP基因廣泛地分布于植物中，但對于它們的功能研究卻相對比較滯后，僅在擬南芥、水稻、辣椒、香蕉和番茄中開展有限的幾個方面的功能研究，包括果實形狀[1]、果實成熟與品質(zhì)[6]、胚珠發(fā)育[7]、維管束的發(fā)育[8]、次生細(xì)胞壁的形成[9]、非生物脅迫[2]以及植物表面質(zhì)積累[3]等。到目前為止，對OFP蛋白功能的研究更多的聚焦在擬南芥和水稻中，而番茄OFP蛋白的功能研究還比較少，僅對OVATE[1，10-12] 和SlOFP20[13-15] 基因的功能進(jìn)行過報道，其他29個OFP蛋白的功能還未見報道。因此，本研究旨在利用生物信息學(xué)方法對番茄OFP基因家族的染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、蛋白序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征及功能、順式作用元件的組成以及在不同組織中的差異表達(dá)等進(jìn)行分析及預(yù)測，以期為進(jìn)一步開展番茄OFP基因家族的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 番茄OFP基因家族成員的鑒定與染色體定位

從茄科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/search/locus）下載其全部蛋白序列，再通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線數(shù)據(jù)庫BLAST下載番茄OFP基因家族全部序列信息。從茄科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/search/locus）獲得OFP基因家族成員在染色體上的位置信息。

利用在線工具M(jìn)G2C（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）制作染色體定位圖。

1.2 番茄OFP基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線數(shù)據(jù)庫下載番茄OFP基因家族成員的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）和DNA序列的FASTA格式。利用GSDS在線網(wǎng)站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因內(nèi)含子和外顯子及非編碼區(qū)的分布圖。

1.3 番茄OFP基因家族蛋白保守基序分析

通過MEME網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/）在線分析蛋白的保守基序，motif設(shè)置為10，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，利用TBtools軟件繪制保守基序圖。

1.4 番茄OFP基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過DNAMAN 6.0軟件完成蛋白序列的氨基酸保守性分析，通過MEGA 6.0軟件完成系統(tǒng)進(jìn)化分析，隨后通過iToL（https：//itol.embl.de/upload.cgi）在線網(wǎng)站對進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.5 番茄OFP基因家族蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析

通過ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，通過GenScript（https：//www.genscript.com/psort.html？src=leftbar）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.6 番茄OFP基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA在線網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.7 番茄OFP基因家族蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬

通過Swiss-Modle在線網(wǎng)站（https：//swissmodel.expasy.org/）完成蛋白的同源建模，以獲取三維結(jié)構(gòu)模型。

1.8 番茄OFP基因家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析

通過茄科基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/search/locus）下載OFP基因家族基因起始密碼子上游3 000 bp區(qū)域序列作為啟動子序列，然后通過PlantCare網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對基因啟動子區(qū)域順式作用元件進(jìn)行預(yù)測分析，通過TBtools軟件繪制啟動子順式作用元件圖。

1.9 番茄OFP基因家族成員轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式分析

通過NCBI PubMed 下載番茄的RNA-seq數(shù)據(jù)，查找搜索31個番茄OFP基因在各組織中的表達(dá)量，利用Helml軟件繪制基因表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄OFP基因家族成員的鑒定與染色體定位

在茄科基因組數(shù)據(jù)庫中檢索OFP蛋白序列信息，再通過NCBI數(shù)據(jù)庫和FGENESH搜索分析，最終共得到31個番茄OFP基因家族成員，并依次將它們命名為OVATE-SlOFP1～OVATE-SlOFP31。為了將這31個成員進(jìn)行染色體定位分析，利用 SGN數(shù)據(jù)庫確定了番茄OFP基因位置信息，結(jié)果表明OFP基因家族在番茄12條染色體上的分布并不均勻，其中10號染色體上分布的成員最多，有9個OFP基因;其次是6號染色體上分布有4個OFP基因;1、3、9號染色體上各有3個OFP基因;其余染色體上分布著 1～2個OFP基因（圖1）。

2.2 番茄OFP基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

對番茄OFP基因家族的編碼序列和基因序列信息進(jìn)行分析，結(jié)果表明番茄OFP基因家族的編碼序列外顯子數(shù)量在1～3個之間，此外，除SlOFP6、SlOFP7、SlOFP12、SlOFP13以外，其他基因均不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（圖2）。這體現(xiàn)出番茄OFP基因家族基因結(jié)構(gòu)簡單的特征。同時也說明番茄OFP基因家族呈現(xiàn)一定的保守性。

2.3 番茄OFP基因家族蛋白保守基序分析

對31個番茄OFP基因家族成員的蛋白序列進(jìn)行保守基序預(yù)測分析，結(jié)果（圖3）表明番茄OFP基因家族蛋白成員具有1～10個保守基序（Motif），只有SlOFP8蛋白不具有Motif1保守基序。另外，除SlOFP11蛋白以外其余所有OFP蛋白都含有Motif2和Motif3保守基序，且先后順序都相同，這說明OFP基因家族在番茄中比較保守。此外，有研究表明，保守基序圖中字母越高，表明該字母對應(yīng)的堿基出現(xiàn)的頻率越大，相對保守程度也越高。由圖3可知，保守基序Motif2保守程度最高，Motif4、Motif6和Motif9基序保守程度也較高，對保守基序進(jìn)行分析將有利于探索蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成。

2.4 番茄OFP基因家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對番茄OFP基因家族蛋白序列進(jìn)行氨基酸組成對比分析，結(jié)果表明OFP基因家族蛋白存在高度保守的氨基酸序列組成的保守結(jié)構(gòu)域（OVATE結(jié)構(gòu)域），這與其在進(jìn)化過程中的功能高度保守密切相關(guān)（圖4）。

為了進(jìn)一步明確番茄OFP基因家族不同蛋白之間的親緣進(jìn)化關(guān)系，基于番茄基因組中31條OFP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，番茄中已經(jīng)被鑒定功能的OVATE和SlOFP20分別與SlOFP6、SlOFP17最同源（圖4）。

2.5 番茄OFP基因家族蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析

利用ExPASy在線軟件對番茄OFP家族編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的氨基酸長度在81～504 之間，其中SlOFP16蛋白氨基酸數(shù)量最多，SlOFP11蛋白氨基酸數(shù)量最少;蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量在10.925 74 ～57.230 52 ku之間，最大的是SlOFP16蛋白，最小的是SlOFP11蛋白;等電點(diǎn)在4.28～10.37之間，最大的是SlOFP17蛋白，最小的是SlOFP24蛋白;脂溶指數(shù)在52.3～88.11之間，最大的是SlOFP11蛋白，最小的是SlOFP31蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)在15.72～74.16之間，最穩(wěn)定的是SlOFP11蛋白，最不穩(wěn)定的是SlOFP15蛋白;蛋白質(zhì)的總平均疏水性數(shù)值在-1.016～-0.140之間，所有蛋白質(zhì)的疏水性數(shù)值均為負(fù)值，說明番茄OFP基因家族蛋白均屬于親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，SlOFP2、SlOFP10蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，SlOFP3、SlOFP6、SlOFP18和SlOFP21蛋白定位于線粒體內(nèi)，SlOFP8、SlOFP19、SlOFP22、SlOFP27、SlOFP29和SlOFP30蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，僅有SlOFP26蛋白定位于過氧化物酶體內(nèi)，其余OFP蛋白皆定位在細(xì)胞核上（表1）。

2.6 番茄OFP基因家族蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA在線軟件對番茄OFP基因家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，番茄OFP蛋白質(zhì)都是由α-螺旋（alpha helix）、β-轉(zhuǎn)角（extended helix）、無規(guī)卷曲（random coil）和延伸鏈（extended strand）等4種二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成（表2）。其中，SlOFP5蛋白幾乎不含β-轉(zhuǎn)角;在SlOFP4的蛋白二級結(jié)構(gòu)中，延伸鏈占比>α-螺旋占比，其余OFP蛋白二級結(jié)構(gòu)中都是α-螺旋占比>延伸鏈占比，并且所有蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲占據(jù)主體部分。因此可以判斷，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是番茄OFP蛋白的主要組成成分，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布于整個蛋白序列中，起輔助修飾作用。

2.7 番茄OFP基因家族蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬

為了解析番茄OFP基因家族的三維構(gòu)象，采用同源建模法，利用Swiss-Modle在線軟件進(jìn)行同源建模。結(jié)果表明，SlOFP4、SlOFP6、SlOFP10、SlOFP14、SlOFP16、SlOFP17、SlOFP20、SlOFP22和SlOFP24蛋白的三級結(jié)構(gòu)相似;SlOFP2和SlOFP21蛋白的三級結(jié)構(gòu)相似;SlOFP5和SlOFP19蛋白的三級結(jié)構(gòu)也相似（圖5）。說明番茄OFP基因家族蛋白之間既存在保守性又存在差異性。

2.8 番茄OFP基因家族基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析

通過SGN數(shù)據(jù)庫獲取番茄OFP基因家族成員起始密碼子ATG上游3 000 bp的序列，接著利用 PlantCARE 網(wǎng)站對其進(jìn)行啟動子順式作用元件分析，結(jié)果（圖6）顯示，番茄OFP基因家族成員起始密碼子上游存在著光響應(yīng)順式元件（G-Box、ACE、GT1-motif）、激素響應(yīng)應(yīng)答元件（CGTCA-motif、P-box、ABRE、TCA-element、AuxRR-core）以及逆境脅迫響應(yīng)順式元件（ARE、TC-rich repeats、LTR、MBS、DRE）。此外，胚乳表達(dá)元件（GCN4_motif）、種子特異性調(diào)控（RY-element）以及分生組織表達(dá)元件（CAT-box）在番茄OFP基因家族成員啟動子上也很常見。僅有SlOFP27基因啟動子上存在干旱、低溫及鹽脅迫響應(yīng)元件（DRE），推測該基因可能參與多個逆境脅迫響應(yīng)過程;SlOFP23、SlOFP26、SlOFP27等 3個基因啟動子上存在黃酮類生物合成基因調(diào)控元件（MBSI），預(yù)測這3個基因可能參與黃酮類生物合成過程。

2.9 番茄OFP基因家族成員轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式分析

為了更好地探究番茄OFP基因家族在番茄生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能，本研究利用3萬多差異基因表達(dá)的番茄RNA-seq數(shù)據(jù)分析了番茄OFP基因在10個番茄組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，OVATE和SlOFP8 2個基因在番茄花和果實中大量表達(dá)，SlOFP14和SlOFP29 2個基因主要在青果時期大量表達(dá)，SlOFP20 基因則主要在番茄花和根中大量表達(dá)（圖7）。

3 討論與結(jié)論

番茄是全球消費(fèi)量最大的蔬菜作物之一，兼具豐富的營養(yǎng)價值和巨大的商業(yè)價值[1]。OFP基因家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，通過赤霉素[8，17]、油菜素內(nèi)酯[18-19]、乙烯[20]以及生長素[2]等多種激素途徑，參與調(diào)控植物生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)的多個方面。近年來，隨著高等植物基因組測序的不斷發(fā)展，研究人員在馬鈴薯、葡萄、擬南芥、水稻、玉米等13種陸地植物中檢測出OFP基因[5]。但僅有少部分OFP基因的功能已被鑒定。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法，對番茄中31個OFP基因進(jìn)行比較全面的生物信息學(xué)分析，為探究番茄OFP基因的生物學(xué)功能提供參考價值。

本研究通過對番茄OFP蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，番茄OFP蛋白均為親水性蛋白，且大部分蛋白不穩(wěn)定，這表明番茄OFP蛋白成員之間存在保守性。此外，通過對番茄OFP蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，α-螺旋和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)是主要的二級結(jié)構(gòu)成分，少量延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角散布于蛋白序列中，起一定輔助修飾的作用。番茄OFP蛋白的三維構(gòu)象則更為直觀的體現(xiàn)出α-螺旋和無規(guī)則卷曲是番茄OFP蛋白的主要組成部分。

在組織特異性表達(dá)方面，OVATE、SlOFP8、SlOFP14、SlOFP20以及SlOFP29基因在果實中大量表達(dá)。另外，OVATE、SlOFP3、SlOFP8、SlOFP10、SlOFP11、SlOFP12、SlOFP18、SlOFP19及SlOFP20基因在花中表達(dá)量比較高，這表明大部分番茄OFP基因可能參與調(diào)控番茄花和果實的生長發(fā)育。然而這些番茄OFP基因具體的功能如何還需后續(xù)研究鑒定。

綜上，本研究利用各種生物信息學(xué)分析網(wǎng)站和軟件對番茄OFP基因家族進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，包括基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)、親緣關(guān)系以及組織特異性分析等。預(yù)測分析結(jié)果為探索OFP基因在番茄各組織生長發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)方面的生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu J，van Eck J，Cong B，et al. A new class of regulatory genes underlying the cause of pear-shaped tomato fruit[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（20）：13302-13306.

[2]Ma Y，Yang C，He Y，et al. Rice OVATE family protein 6 regulates plant development and confers resistance to drought and cold stresses[J]. Journal of Experimental Botany，2017，68（17）：4885-4898.

[3]Tang Y，Zhang W，Yin Y L，et al. Expression of ovate family protein 8 affects epicuticular waxes accumulation in Arabidopsis thaliana[J]. Botanical Studies，2018，59（1）：12.

[4]Wang S，Chang Y，Guo J，et al. Arabidopsis ovate family proteins，a novel transcriptional repressor family，control multiple aspects of plant growth and development[J]. PLoS One，2011，6（8）：e23896.

[5]Liu D，Sun W，Yuan Y W，et al. Phylogenetic analyses provide the first insights into the evolution of OVATE family proteins in land plants[J]. Annals of Botany，2014，113（7）：1219-1233.

[6]Liu J H，Zhang J，Wang J Y，et al. MuMADS1P and MaOFP1 regulate fruit quality in a tomato ovate mutant[J]. Plant Biotechnology Journal，2017，16（5）：989-1001.

[7]Pagnussat G C，Yu H J，Sundaresan V. Cell-fate Switch of synergid to egg cell in Arabidopsis eostre mutant embryo sacs arises from misexpression of the BEL1-like homeodomain gene BLH1[J]. The Plant Cell，2007，19（11）：3578-3592.

[8]Schmitz A J，Begcy K，Sarath G，et al. Rice ovate family protein 2 （OFP2） alters hormonal homeostasis and vasculature development[J]. Plant Science，2015，241：177-188.

[9]Li E Y，Wang S C，Liu Y Y，et al. OVATE FAMILY PROTEIN4 （OFP4） interaction with KNAT7 regulates secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal，2011，67（2）：328-341.

[10]Liu J H，Zhang J，Miao H X，et al. Elucidating the mechanisms of the tomato ovate mutation in regulating fruit quality using proteomics analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2017，65（46）：10048-10057.

[11]Rodríguez G R，Kim H J，Van Der Knaap E. Mapping of two suppressors of OVATE （sov） loci in tomato[J]. Heredity，2013，111（3）：256-264.

[12]Wang Y，Clevenger J P，Illa-Berenguer E，et al. A comparison of sun，ovate，fs8.1 and auxin application on tomato fruit shape and gene expression[J]. Plant & Cell Physiology，2019，60（5）：1067-1081.

[13]Zhou S E，Hu Z L，Li F F，et al. Overexpression of SlOFP20 affects floral organ and pollen development[J]. Horticulture Research，2019，6（1）：125.

[14]Zhou S E，Cheng X，Li F F，et al. Overexpression of SlOFP20 in tomato affects plant growth，chlorophyll accumulation，and leaf senescence[J]. Frontiers in Plant Science，2019，10：1510.

[15]Wu S，Zhang B，Keyhaninejad N，et al. A common genetic mechanism underlies morphological diversity in fruits and other plant organs[J]. Nature Communications，2018，9（1）：4734.

[16]霍建勇.中國番茄產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及安全防范[J]. 蔬菜，2016（6）：1-4.

[17]Wang S C，Chang Y，Guo J J，et al. Arabidopsis Ovate Family Protein 1 is a transcriptional repressor that suppresses cell elongation[J]. The Plant Journal，2007，50（5）：858-872.

[18]Yang C，Ma Y M，He Y，et al. OsOFP19 modulates plant architecture by integrating the cell division pattern and brassinosteroid signaling[J]. The Plant Journal，2018，93（3）：489-501.

[19]Yang C，Shen W J，He Y，et al. OVATE family protein 8 positively mediates brassinosteroid signaling through interacting with the GSK3-like kinase in rice[J]. PLoS Genetics，2016，12（6）：e1006118.

[20]Liu J H，Zhang J，Hu W，et al. Banana ovate family protein MaOFP1 and MADS-box protein MuMADS1 antagonistically regulated banana fruit ripening[J]. PLoS One，2015，10（4）：e0123870.