邱 銳 史艷平 趙珍珍

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)2019級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是由化學(xué)藥、生物制劑、傳統(tǒng)中草藥等引起的肝臟損害，是世界各國藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用中導(dǎo)致急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)的主要問題[1-2]。對乙酰氨基酚(APAP)是導(dǎo)致DILI的常見原因之一。雖然APAP在治療劑量下是安全的，但是過度使用會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟損傷，甚至ALF[3-4]。根據(jù)DILI臨床表現(xiàn)及特點(diǎn)可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”“黃疸”“鼓脹”等范疇[5]。陜西省西安市兒童醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科史艷平主任醫(yī)師基于多年臨床經(jīng)驗(yàn)及“相火”理論，所擬經(jīng)驗(yàn)方參靈頤肝湯在DILI治療中取得較好療效，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探究參靈頤肝湯對APAP所致肝損傷小鼠的治療效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級ICR小鼠50只，體質(zhì)量(15±4)g，4周齡，雌雄各半，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2020-030]，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室，試養(yǎng)7 d，觀察小鼠處于正常狀態(tài)，飼養(yǎng)期間各小鼠自由飲水，飼料購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在24 ℃左右，濕度控制在50%～70%。

1.2 藥品及試劑 參靈頤肝湯藥物組成：北沙參8 g，麥冬8 g，白芍10 g，靈芝8 g，五味子10 g，紫草10 g，茜草10 g，生地黃8 g，百合8 g，佛手8 g，甘草8 g，購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院。取藥材加10倍水浸泡后煎煮3次，取出藥液合并過濾，濃縮至3.5 g/mL。對乙酰氨基酚(北京索萊寶科技有限公司，批號A9421)以蒸餾水稀釋配置成濃度為25 mg/mL的溶液；乙酰半胱氨酸(北京索萊寶科技有限公司，批號C8460)以蒸餾水稀釋配置成濃度為10 mg/mL溶液。試劑盒：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號C009-2)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號C010-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號A003-1)、總膽紅素(TBiL)試劑盒(批號C019-1)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號A001-1)，均購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素6(IL-6)試劑盒(批號EK206/3-01)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒(批號88-7324)，均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 儀器 5417 R高速臺式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；ELXSOSIU全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；R136石蠟切片機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；TC-120S+生物組織自動脫水機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；TB-718EL冷凍臺、包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；TK-218Ⅱ生物組織攤片、烤片機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司)；電子精密天平(德國賽多利斯公司)；CL-300W制冰機(jī)(上海岑隆電器設(shè)備有限公司)；超低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)；GL150干式恒溫箱(上海雙旭電子有限公司)；XHF-D高速勻漿器(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；微量移液器(北京普利智誠生物技術(shù)有限公司)；光學(xué)顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 試養(yǎng)7 d后，將50只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組、兩藥聯(lián)用組，每組10只，雌雄各半。

1.4.2 造模及給藥 造模：空白對照組予0.9%氯化鈉注射液0.13 mL/10 g灌胃；其余4組予APAP溶液0.13 mL/10 g灌胃。每2 d 1次，連續(xù)2周，建立急性肝損傷模型。前期實(shí)驗(yàn)研究顯示，以APAP溶液0.13 mL/10 g連續(xù)灌胃2周，小鼠血清中AST、ALT水平顯著升高，光學(xué)顯微鏡下觀察到小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，炎癥細(xì)胞呈彌漫性浸潤，提示小鼠急性肝損傷模型制作成功。灌胃給藥：造模成功后，空白對照組、模型組予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL/10 g灌胃；乙酰半胱氨酸組予乙酰半胱氨酸溶液0.1 mL/10 g腹腔注射；參靈頤肝湯組予參靈頤肝湯0.2 mL/10 g灌胃；兩藥聯(lián)用組予參靈頤肝湯0.2 mL/10 g灌胃聯(lián)合乙酰半胱氨酸溶液0.1 mL/10 g腹腔注射。每日1次，連續(xù)2周。

1.5 觀察指標(biāo) ①小鼠末次灌胃給藥后禁食不禁水，24 h后稱體質(zhì)量并取材。全部小鼠用4%水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，采用摘眼球取血法取血0.4～0.5 mL，將血液在室溫下穩(wěn)定15 min，3000 r/min離心10 min，取血清，采用微板法檢測AST、ALT含量，采用釩酸氧化法檢測TBiL含量，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。②采用脫臼法處死小鼠，立即解剖取出肝臟組織，取肝左葉0.2 g，利用高速勻漿器制成10%肝組織勻漿。將制備好的肝臟勻漿液以5000 r/min離心10 min,取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-6、TNF-α含量，采用羥胺法檢測SOD含量，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。③于肝臟右葉上取大小約5 mm×5 mm×4 mm的組織，置于4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。制成切片后分別在100倍、400倍光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平比較 見表1。

表1 各組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平比較

由表1可見，與空白對照組比較，模型組、乙酰半胱氨酸組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均升高(P<0.05)；參靈頤肝湯組小鼠血清AST、ALT水平均升高(P<0.05)，TBiL水平無明顯變化(P>0.05)；兩藥聯(lián)用組小鼠血清AST水平升高(P<0.05)，ALT、TBiL水平無明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、兩藥聯(lián)用組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均降低(P<0.05)；參靈頤肝湯組小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)，ALT水平無明顯變化(P>0.05)。與乙酰半胱氨酸組比較，參靈頤肝湯組、兩藥聯(lián)用組小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)，ALT水平無明顯變化(P>0.05)。與參靈頤肝湯組比較，兩藥聯(lián)用組小鼠血清ALT水平降低(P<0.05)，AST、TBiL水平無明顯變化(P>0.05)。

2.2 各組小鼠肝組織IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比較 見表2。

表2 各組小鼠肝組織IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平比較

由表2可見，與空白對照組比較，模型組、乙酰半胱氨酸組小鼠肝組織IL-6、MDA水平均升高(P<0.05)，SOD水平均降低(P<0.05)，TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)；參靈頤肝湯組、兩藥聯(lián)用組小鼠肝組織SOD水平均降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、MDA水平均無明顯變化(P>0.05)。與模型組比較，乙酰半胱氨酸組小鼠肝組織IL-6、TNF-α、MDA水平均降低(P<0.05)，SOD水平升高(P<0.05)；參靈頤肝湯組、兩藥聯(lián)用組小鼠肝組織IL-6、MDA水平均降低(P<0.05)，TNF-α、SOD水平變化不明顯(P>0.05)。與乙酰半胱氨酸組比較，參靈頤肝湯組小鼠肝組織MDA水平降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、SOD水平變化不明顯(P>0.05)；兩藥聯(lián)用組小鼠肝組織IL-6、MDA水平均降低(P<0.05)，TNF-α、SOD水平變化不明顯(P>0.05)。與參靈頤肝湯組比較，兩藥聯(lián)用組小鼠肝組織IL-6水平降低(P<0.05)，TNF-α、SOD、MDA水平變化不明顯(P>0.05)。

2.3 各組小鼠肝組織病理變化 空白對照組小鼠肝細(xì)胞核排列規(guī)整，可以清晰地看到肝小葉結(jié)構(gòu)；模型組小鼠肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度壞死、變性，肝索紊亂并伴有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組及兩藥聯(lián)用組肝組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組有少量炎性浸潤，細(xì)胞壞死的現(xiàn)象減輕，兩藥聯(lián)用組細(xì)胞排列比較整齊，未見大面積炎性浸潤及壞死，與空白對照組最為相似。見圖1、2。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化(HE，×100)

圖2 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化(HE，×400)

3 討論

DILI大多數(shù)臨床癥狀不明顯，但也有少數(shù)表現(xiàn)為肝區(qū)不適、乏力、厭食、皮疹等，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)ALF，DILI已成為國際肝病和消化病學(xué)研究的熱點(diǎn)[6-7]。APAP是兒童使用最廣泛的非處方藥物之一，服用過量可導(dǎo)致嚴(yán)重肝毒性，這已成為全球公共健康問題[8-9]。APAP是由細(xì)胞色素p450s代謝生成活性代謝物N-乙酰-對苯醌亞胺(NAPQI)，主要通過細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)代謝。然而，APAP過度使用后，NAPQI對肝細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)谷胱甘肽過多的消耗。剩余的NAPQI與細(xì)胞生物大分子，特別是蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，導(dǎo)致線粒體受損，肝細(xì)胞死亡，甚至肝衰竭[4,10]。目前，DILI無特異性治療方法，主要是在停用可疑藥物基礎(chǔ)上給予對癥治療，可以采用的西藥主要分為利膽類、降酶類、解毒類、抗炎類保肝藥物，以乙酰半胱氨酸、甘草酸鎂、聯(lián)苯雙酯等為代表，可通過增強(qiáng)肝臟解毒作用，減少有害物質(zhì)對肝臟損害，促進(jìn)膽汁分泌，減輕膽汁淤積，抗炎，降低轉(zhuǎn)氨酶等起到保肝護(hù)肝作用[11]。乙酰半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的N-乙酰衍生物，是預(yù)防因服用過量APAP引起的肝毒性的首選藥物及唯一解毒藥物，被認(rèn)為是谷胱甘肽的替代品和前體，并與NAPQI結(jié)合，同時(shí)補(bǔ)充耗盡的谷胱甘肽儲備，特別是在肝臟[12-13]。然而臨床應(yīng)用往往難以取得滿意療效。

近年來中醫(yī)藥治療DILI已得到眾多醫(yī)家認(rèn)可，有報(bào)道稱中藥治療DILI具有多靶點(diǎn)、改善肝臟微循環(huán)、強(qiáng)抗氧化、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)[5]。然而對于中藥系統(tǒng)機(jī)制研究較為缺乏，不能為指導(dǎo)臨床用藥提供依據(jù)。以益氣養(yǎng)陰，兼柔肝利膽、涼血解毒為治則擬方的參靈頤肝湯在臨床上取得較好療效，但具體作用機(jī)制尚不清楚。故研究以參靈頤肝湯對DILI小鼠模型治療前后小鼠一般情況及相關(guān)指標(biāo)水平的變化，探討參靈頤肝湯治療DILI的作用機(jī)制。參靈頤肝湯君以北沙參、靈芝益氣養(yǎng)陰，補(bǔ)益肝氣；北沙參不僅防木旺侮金，亦能養(yǎng)肺陰。臣以麥冬、五味子、白芍助君藥養(yǎng)陰柔肝保肝；茜草、紫草涼血解毒。佐以百合、生地黃，百合助臣藥養(yǎng)肝體，潤肺防“木旺侮金”；生地黃養(yǎng)陰清熱。佛手、甘草為使藥，佛手疏肝氣，引藥入肝經(jīng)，還可防止大量養(yǎng)陰藥阻礙肝氣條達(dá)；甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥。諸藥配伍，既能補(bǔ)肝體之陰，又可柔斂肝氣，兼能疏肝利膽，理氣解毒，清熱涼血?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，北沙參可以降低大鼠血清AST、ALT、MDA含量,提高肝臟勻漿液中SOD含量，而且北沙參可以抑制大鼠肝細(xì)胞中的一氧化氮(NO)產(chǎn)生[14-15]；靈芝具有降低肝臟血脂水平，保肝護(hù)肝的作用[16]；五味子多糖、紫草對DILI肝組織具有保護(hù)作用[17-18]。

DILI通常沒有具體的臨床表現(xiàn)，許多患者可能只表現(xiàn)為肝臟生化指標(biāo)水平升高。臨床上檢測DILI的傳統(tǒng)血清生物標(biāo)志物有ALT、AST和TBiL[6]。肝細(xì)胞膜受損時(shí),細(xì)胞內(nèi)的AST、ALT就會釋放入血,導(dǎo)致血清AST、ALT水平升高。有研究發(fā)現(xiàn)，APAP毒性引起的肝功能障礙最初是通過檢測AST和ALT濃度來確定的[19]。TBiL是肝臟生化指標(biāo)，當(dāng)肝臟受損害后，其水平會明顯增加[20]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清AST、ALT、TBiL水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、兩藥聯(lián)用組ALT均降低(P<0.05)，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組、兩藥聯(lián)用組小鼠血清AST、TBiL水平均降低(P<0.05)。表明參靈頤肝湯、乙酰半胱氨酸在一定程度上改善了APAP致DILI小鼠的肝損傷程度。兩藥聯(lián)用組比參靈頤肝湯組、乙酰半胱氨酸組AST、ALT及TBiL水平降低更加明顯，說明兩藥聯(lián)用組改善DILI小鼠肝損傷程度更加有效。

IL-6是與炎癥性疾病相關(guān)的細(xì)胞因子的核心成員，又被稱為肝細(xì)胞刺激因子，在肝臟再生的過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，IL-6不僅是肝臟炎癥的重要指標(biāo),也是判斷肝臟炎癥和預(yù)后的重要實(shí)驗(yàn)指標(biāo)[21]。TNF-α為促進(jìn)炎性反應(yīng)的重要因子，已被認(rèn)為是DILI發(fā)病的核心介質(zhì)，當(dāng)TNF-α的表達(dá)過度時(shí)，體內(nèi)免疫細(xì)胞遭受刺激，合成更多炎癥因子，包括IL-1β、IL-6等，共同刺激炎癥發(fā)生及發(fā)展，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的浸潤，發(fā)生急性的肝臟炎性損害[22-23]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組肝組織IL-6水平升高(P<0.05)，經(jīng)過乙酰半胱氨酸、參靈頤肝湯、乙酰半胱氨酸聯(lián)合參靈頤肝湯治療后，小鼠肝組織IL-6水平均降低(P<0.05)，說明參靈頤肝湯及乙酰半胱氨酸可以在一定程度上抑制炎癥因子IL-6的產(chǎn)生，保護(hù)APAP所致的肝損傷，且與乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組比較，兩藥聯(lián)用組肝組織IL-6降低(P<0.05)，表明乙酰半胱氨酸與參靈頤肝湯聯(lián)合用藥效果更好。

SOD是一種廣泛存在于生物體中的金屬酶，具有很強(qiáng)的抗氧化功能，它能催化自由基歧化，去除脂質(zhì)過氧化物和氧自由基，保護(hù)肝細(xì)胞免受損害，保持氧化與抗氧化反應(yīng)的穩(wěn)定性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的抗氧化活性可以直接反映肝臟的抗氧化能力[24]。MDA是脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物，可破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。MDA含量可反映脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷程度。SOD活性可間接反映氧自由基的清除能力，MDA含量可間接反映自由基誘導(dǎo)的損傷程度[25]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織中SOD活性均下降、MDA水平均升高(P<0.05)，說明小鼠的抗氧化能力遭受嚴(yán)重破壞，肝組織發(fā)生了氧化損傷；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組、參靈頤肝湯組、兩藥聯(lián)用組小鼠肝組織MDA水平均降低(P<0.05)。表明乙酰半胱氨酸及參靈頤肝湯可以通過增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化能力減輕肝損傷程度。

綜上，在APAP致DILI模型小鼠中，參靈頤肝湯可以減輕肝臟炎癥，改善肝臟損傷的程度，其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡和抗炎、抗氧化有關(guān)。因此，參靈頤肝湯可以作為臨床治療兒童DILI藥物。但本實(shí)驗(yàn)樣本量偏少，為進(jìn)一步了解參靈頤肝湯對APAP致DILI小鼠的治療效果及作用機(jī)制，仍需進(jìn)行深入研究。