兔骨折血腫細胞分離回植對骨折愈合的影響及機制的研究

馬震卓 郝 鑫 石光耀 張 霖 于淑紅 申國強 蔡成坤 張 新

對骨折愈合的研究隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)從細胞生物學(xué)水平深化到分子生物學(xué)水平［1-3］。研究者［3-6］發(fā)現(xiàn)，在骨折血腫細胞中存在各種生長因子，包括血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）、血管內(nèi)皮生長 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及骨保護素（osteoprotegerin，OPG）等。盡管各種生長因子在骨組織及血腫細胞中含量較少，但在骨折愈合過程的不同時期中，對調(diào)節(jié)骨細胞分裂、細胞黏附、細胞增殖、細胞遷移、細胞外基質(zhì)合成及組織分化等起著不可替代的作用［7-10］。

方 法

1.實驗動物

選取雄性新西蘭大白兔36只（北華大學(xué)中心實驗室提供），體重2.5~3 kg，兔齡7~8個月。平均分成實驗組和對照組，每組18只動物。

2.骨折模型制備和分組處理

用25%烏拉坦麻醉劑對實驗兔進行麻醉，按4 ml/kg經(jīng)耳緣靜脈緩慢推注，麻醉后固定于手術(shù)臺上，對實驗兔右下肢股骨髁上下5 cm范圍進行剪毛處理，局部碘伏消毒3遍，股骨髁上部周圍注射鹽酸利多卡因浸潤麻醉，用外骨折器在股骨髁上制作閉合骨折模型［7，11］。骨折兔放置2 h后，無菌操作，切開皮膚肌肉，分組進行相應(yīng)處理。

實驗組：快速收集骨折斷端周圍血腫細胞液，無菌條件下制備并分離骨折血腫細胞，對骨折斷端行鋼針內(nèi)固定。將可吸收性明膠海綿吸附分離后的血腫細胞液，放置于骨折斷端，使其緩慢釋放。對照組：按常規(guī)方法去除骨折斷端周圍血腫細胞液后行鋼針內(nèi)固定。分別于術(shù)后第10、20、30天，每組各隨機選取6只動物處死，取材后進行影像學(xué)和組織學(xué)觀察。

3.X線檢查

觀察股骨髁骨折處骨痂形成數(shù)量，骨質(zhì)密度情況。影像學(xué)評分標準：①0分，骨折斷端邊緣清晰，無骨膜反應(yīng)；②1分，骨折斷端邊緣較模糊，輕微骨膜反應(yīng)；③2分，骨折邊緣模糊，骨膜反應(yīng)淺、少量骨痂、密度淡；④3分，骨折斷端接近消失，骨膜反應(yīng)深、骨痂增多、密度深；⑤4分，骨折斷端邊緣完全消失，骨膜反應(yīng)近似骨影、骨痂充滿缺損區(qū)、密度與骨皮質(zhì)相同。

4.組織學(xué)觀察

在無菌條件下取骨，將股骨干周圍軟組織清除干凈，在距股骨髁骨折處兩端1 cm處整齊鋸下標本骨，將其放入10%中性甲醛溶液中，固定12 h后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，再加入10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脫鈣5周后，經(jīng)脫水-透明-浸蠟-包埋備用。

4.1 HE染色及觀察

制作石蠟切片，以5 mm厚度為標準。經(jīng)脫蠟-水化-蘇木精染色-鹽酸酒精分化-伊紅染色-脫水透明，最后中性樹膠封片。光鏡下觀察HE染色切片，觀察骨痂生長的組織形態(tài)，以及HE染色骨組織切片中成骨細胞的數(shù)量。

4.2 免疫組織化學(xué)染色（SP法）

將標本分組，分別滴加蒸餾水稀釋后，加入1︰300的PDGF抗體、TGF?β抗體作為一抗。放置于4℃冰箱過夜12 h，在標本中分別滴加SP（鏈霉親和素?過氧化物酶），滴加已經(jīng)先配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色溶液顯色，放入蘇木精溶液中復(fù)染。在顯微鏡下鏡檢觀察，同時記錄數(shù)據(jù)，照相、存盤。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

采用spss19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，符合正態(tài)分布者采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.一般情況

2組實驗兔術(shù)后1周進食恢復(fù)正常，活動恢復(fù)正常，切口無感染。術(shù)側(cè)肢體可自然活動。

2.X線表現(xiàn)

術(shù)后第10天，2組實驗兔均無明顯骨痂形成，實驗組骨折斷端輕度模糊征象。術(shù)后第20天，對照組骨折斷端邊緣模糊，多數(shù)均無明顯骨痂形成；實驗組骨折斷端見有少量骨痂形成，骨痂的密度低于正常的骨質(zhì)的密度。術(shù)后第30天，對照組與實驗組骨折斷端均有骨痂出現(xiàn)，且骨痂密度均高于術(shù)后第20天，實驗組骨痂量明顯高于對照組，少數(shù)對照組骨折斷端局部可見低密度骨折線。2組影像學(xué)評分詳見表1。

表1 實驗組與對照組術(shù)后不同時間影像學(xué)評分

3.HE染色結(jié)果

實驗兔術(shù)后不同時間骨折斷端標本HE染色結(jié)果見圖1。對HE染色切片中的細胞進行計數(shù)，結(jié)果（表2）顯示，術(shù)后第10、20、30天，實驗組中的成骨細胞數(shù)量均多于對照組。

表2 實驗組與對照組成骨細胞數(shù)量對比

圖1 實驗組和對照組術(shù)后不同時間骨折斷端標本HE染色結(jié)果

4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

4.1 PDGF在骨組織中的表達

實驗兔術(shù)后不同時間骨組織PDGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2。術(shù)后第10天，實驗組成骨細胞免疫表達弱陽性；對照組無陽性表達，僅見骨細胞存在。術(shù)后第20天，實驗組成骨細胞免疫表達為強陽性；對照組免疫弱陽性表達。術(shù)后第30天，實驗組骨細胞免疫表達強陽性，與術(shù)后第20天的表達強度相仿；對照組弱陽性表達。實驗兔術(shù)后不同時間骨組織PDGF表達強度詳見表3。

圖2 實驗組與對照組骨組織PDGF的表達（×40）

表3 骨折愈合不同時間成骨細胞PDGF的表達

4.2 TGF-β在骨組織中的表達

實驗兔術(shù)后不同時間骨組織TGF?β免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖3。術(shù)后第10天，實驗組在骨組織骨小梁周圍見少量顏色較淺淡的棕黃色顆粒，為成骨細胞TGF?β的弱陽性表達；對照組沒有陽性表達，僅見骨細胞存在。術(shù)后第20天，實驗組骨組織骨小梁周圍見密集排列的成骨細胞，其顏色為深棕黃色顆粒改變，TGF?β呈強陽性表達；對照組仍沒有陽性表達。術(shù)后第30天，實驗組骨組織骨小梁周圍成骨細胞數(shù)量減少，TGF?β表達強度有所降低，但仍比術(shù)后第10天強；對照組骨組織周圍見少量淺淡的棕黃色顆粒，呈弱陽性表達。實驗兔術(shù)后不同時間骨組織TGF?β表達強度詳見表4。

表4 骨折愈合不同時間成骨細胞TGF?β的表達

圖3 實驗組與對照組骨組織TGF?β的表達（×40）

討 論

骨折血腫能夠促進骨折愈合已經(jīng)被人們所認知，國內(nèi)外已經(jīng)有大量的實驗及病例報道［12-15］，骨折血腫在增加骨痂形成數(shù)量、加速骨痂形成、縮短骨折愈合時間方面有著顯著的促進作用［16］。

骨折愈合是復(fù)雜的修復(fù)再生過程，主要包括早期的損傷反應(yīng)期，中期的膜內(nèi)化成骨期、軟骨形成期和晚期的軟骨內(nèi)化骨。機體出現(xiàn)骨折后，骨折斷端及周圍軟組織形成血腫，血腫細胞內(nèi)富含多種生長因子及大量炎性細胞，促進骨折傷口愈合的同時清除壞死的炎性組織，為骨折愈合全過程起到良好的開始作用［17-20］。本研究結(jié)果提示，骨折血腫分離細胞回植后，骨組織表達的細胞因子在骨折愈合的不同時期發(fā)揮著重要作用。

本實驗結(jié)果表明，骨折血腫分離細胞回植后，骨折愈合無明顯感染及排斥反應(yīng)，提示其可促進骨折愈合。在HE染色切片任選視野下觀察，可見成骨細胞規(guī)則排列在骨組織表面，呈棕黃色強陽性表達。在骨折愈合不同時期，成骨細胞數(shù)量有所不同。X線片骨折斷端骨痂定量分析證實，實驗組較對照組骨痂形成時間短，數(shù)量多。通過測定骨折愈合不同時間骨組織PDGF和TGF?β的表達，證實促進骨折愈合的分子機制可能部分與其中PDGF及TGF?β的表達增強有關(guān)。

骨折早期，PDGF表達逐漸增強，促進成骨細胞DNA合成，加速其復(fù)制潛能，誘導(dǎo)軟骨細胞分化為成骨細胞，以促進纖維骨痂的形成。骨折晚期，在骨折斷端骨痂形成較多，骨痂塑形開始，骨折處骨細胞的吸收與破壞是同時進行的，此時PDGF呈強陽性表達，同樣說明其加速骨折愈合，發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)骨折愈合的作用。從分子水平上研究骨折修復(fù)的機制，已成為骨折愈合修復(fù)的前沿研究方向，將有助于骨折治療研究的開展及新策略的制訂，并指導(dǎo)臨床工作中對骨折后早期血腫處理，最終對促進骨折愈合、防止延遲愈合或不愈合等并發(fā)癥有重要意義。