楊曉，黃仁燕，李文惠，樊煒靜，徐烽，閆少慶，柳國斌

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中醫(yī)血管外科，上海 201203)

下肢靜脈性潰瘍(venous leg ulcer，VLUs)是下肢小腿潰瘍中最常見的一種疾病，是繼發(fā)于下肢慢性靜脈功能不全晚期最嚴重和難治的并發(fā)癥，常經(jīng)久不愈[1]，其發(fā)病率高，愈合慢且易復(fù)發(fā)[2]，隨著年齡的增加發(fā)病率和患病率逐漸升高[3]。VLUs的愈合是一個非常復(fù)雜的過程，需要大量炎癥細胞的浸潤、血管再生形成肉芽組織、成纖維細胞遷移、纖維母細胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細胞、膠原沉積 、表皮再生。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是組織損傷修復(fù)與纖維化過程中關(guān)鍵的誘導(dǎo)因子。有效的細胞因子對于瘡面愈合至關(guān)重要[4]。紫朱軟膏是奚九一教授以“補虛祛瘀生肌法”為原則研制的外用藥物，具有清熱解毒、祛腐生肌、補氣益血之功效。紫朱軟膏組成藥物與TGF-β1/Smad3信號通路關(guān)系已有相關(guān)的研究[5]，筆者在本研究主要研究紫朱軟膏與TGF-β1/Smads信號通路的關(guān)系，通過檢測 TGF-β/Smads 信號通路中的關(guān)鍵蛋白，初步探討此通路在VLUs愈合過程中的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年新西蘭雄性大白兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2009-0069。飼養(yǎng)環(huán)境： 室溫為(23±2)℃，相對濕度為(56±10)%。以標準顆粒飼料飼養(yǎng)，動物自由攝食及飲水。

1.2試藥 外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子(商品名：貝復(fù)濟，rb-bFGF，珠海億勝生物制藥公司，批準文號：國藥準字 S10980077)；α-SMA抗體(美國Sigma公司，貨號：A2547)，PCNA抗體(美國Novus Biologicals公司，貨號：NB500-106)，TGF-β1抗體(美國R&D Systems公司，貨號：MAB240-100)，p-Smad2、p-Smad3(廣州智造軟件科技有限公司，貨號：9520s)，Smad7(美國Sigma公司，貨號：AV32008)。

1.3儀器 光學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司，型號：BK-FL21)，熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號：ChemiQ4600)，數(shù)碼相機(日本Canon公司，型號：5D Mark Ⅲ)，酶標儀(THERMO公司，型號：MK3)。

1.4紫朱軟膏制備方法

1.4.1紫朱軟膏藥物組成及配比 根據(jù)紫朱軟膏100 kg處方量，主要藥材：朱砂3.5 kg，紫草1.5 kg，龍血竭3 kg，黃芪1.5 kg，阿膠2.5 kg，冰片0.5 kg；輔料：白凡士林47.25 kg，羊毛脂15 kg，泊洛沙姆188為12 kg，聚乙二醇4000為0.5 kg，1，2-丙二醇2.5 kg，單硬脂酸甘油酯5.25 kg，對羥基苯甲酸乙酯0.03 kg，水5 kg。

1.4.2特殊藥材前處理 朱砂采用200目(內(nèi)徑0.075 mm)水飛朱砂工業(yè)化成品；阿膠以電動粉碎機粉碎為內(nèi)徑0.250 mm(60目)粉末；紫草、冰片為有效成分熱不穩(wěn)定藥材，采用氣流粉碎方式處理；黃芪纖維性較強，先以8倍量75%乙醇提純2次，再將醇提后藥渣以6倍量水提取3次，得到醇提取和水提取浸膏；龍血竭制備成固體分散體以改善其在輔料中的分散性。

1.4.3軟膏制劑的制備工藝方法 將上述處理好藥材與水溶性基質(zhì)按照優(yōu)化的工藝流程混勻，制成軟膏制劑。具體通過下述步驟制備：①龍血竭固體分散體的制備：龍血竭用適量90%～95%乙醇溶解完全，加入80～85 ℃熔融的泊洛沙姆188中，攪拌均勻，揮去95%乙醇，得到龍血竭固體分散物。②黃芪提取物用適量純水混勻，阿膠加純水，55～60 ℃下烊化，形成阿膠水溶液；并將上述兩種水溶液混合均勻后加入到熔融的泊洛沙姆407中，持續(xù)攪拌均勻；另在不超過40 ℃下將冰片溶解在丙三醇中，加入到上述混合物，攪拌均勻后，再加入聚乙二醇400、聚乙二醇1500及聚乙二醇4000，混合均勻后將其加入到龍血竭的固體分散物中，持續(xù)攪拌均勻冷卻至室溫。③將朱砂細粉、紫草細粉加入，并加入對羥基苯甲酸乙酯，持續(xù)攪拌使其分散均勻即得。將制成的紫朱軟膏加熱溶解，制成紫朱軟膏紗布，每日用無菌剪刀剪成與瘡面大小一致的形狀，消毒后備用。紫朱軟膏主藥與基質(zhì)的比例為1：8，1 g藥膏的生藥質(zhì)量是0.11 g。

1.5動物分組 42只新西蘭雄性大白兔按照隨機數(shù)字表法分為7組，每組各6只：VLUs+紫朱軟膏低劑量組(a1組)、VLUs+紫朱軟膏中劑量組(a2組)、VLUs+紫朱軟膏高劑量組(a3組)、VLUs+生長因子組(b組)、VLUs模型組(c組)、一般潰瘍組(d組)、VLUs+基質(zhì)組(e組)。

1.6動物模型的制備 除d組外，其他動物制備VLUs模型。VLUs模型由靜脈高壓聯(lián)合潰瘍模型的方法建立，方法如下。①靜脈高壓模型：采用下肢深靜脈血栓模型術(shù)建立。大白兔腹腔注射3%戊巴比妥鈉 1 mL·kg-1麻醉，仰臥位，四肢固定，雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮。左側(cè)腹股溝區(qū)切口，分離皮下組織和淺筋膜等，分離股動脈、股靜脈，分離并暴露髂-股靜脈約1.0 cm。在其近、遠心端用兔動脈夾夾閉此靜脈，然后用無齒小蚊式鉗夾閉血管，時間持續(xù)2～3 s。松開蚊式鉗并進行縫合，局部皮膚常規(guī)消毒。手術(shù)后24 h，將放置的動脈夾取出。可吸收縫線逐層縫合皮下組織層和皮膚。②一般潰瘍模型采用潰瘍模型建立方法。在兔小腿脛前距離足尖6 cm處，定為中心點，備皮3 cm區(qū)域，再以中心點為圓心，用龍膽紫溶液做直徑 1.5 cm 圓形標記。在圓形標記處做一“十“字形切口，準備一個鐵氧體磁鐵(直徑15 mm，厚5 mm)植入皮膚下切口。接下來，用另一個磁鐵夾住切割皮膚。用棉花和紗布綁扎，膠布固定，1周之后，兩個磁鐵被移除，夾皮自然脫落，產(chǎn)生潰瘍。用組織剪修剪整齊。

1.7給藥方法 a1，a2，a3組：用紫朱軟膏藥物均勻涂抹于創(chuàng)面，分別用1，2，3層紫朱軟膏紗布，約2，4，6 g·(cm2)-1。 b組：用rb-bFGF噴灑于瘡面，每次噴3次，約100 U·(cm2)-1。c、d組未給予藥物，每次用兩層紗布覆蓋換藥。e組：基質(zhì)用凡士林，制作方法同紫朱軟膏，制成凡士林紗布，紗布與瘡面大小一致，每次用兩層紗布覆蓋。

1.8瘡面愈合時間觀察 觀察各組瘡面大小、顏色、分泌物、肉芽組織情況及創(chuàng)面隨時間推移的變化。以創(chuàng)面完全上皮化為標準，比較各組大白兔創(chuàng)面面積變化情況。采用數(shù)碼照相機聯(lián)合醫(yī)學(xué)圖像分析軟件計算，使用數(shù)碼相機采集的圖片導(dǎo)入計算機，選出最清晰圖片，應(yīng)用 Image J-ijl33-jdk15計算，潰瘍創(chuàng)面愈合率(%)=(初始面積-觀察時間點面積)/初始面積×100%。

1.9愈合評價 采取 3 級愈合評價法，分為完全愈合、部分愈合和不愈合。完全愈合為潰瘍面完全愈合；部分愈合為潰瘍面愈合>50%；不愈合為潰瘍面愈合<50%。

1.10蘇木精-伊紅(HE)染色實驗 將新西蘭大白兔在造模成功后第1，7，21天在皮損長徑邊緣取材，將組織塊用10%甲醛溶液固定，乙醇脫水、石蠟包埋、制作病理切片，進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組瘡面組織病理學(xué)變化。

1.11TGF-β1/smads 信號通路及下游調(diào)控基因關(guān)鍵蛋白檢測 采用免疫印跡(Western blotting)技術(shù)進一步檢測。觀察這些調(diào)控基因表達關(guān)鍵蛋白(TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad7、α-SMA)在創(chuàng)面組織修復(fù)過程中的分布特點。使用β- actin) 作內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1瘡面愈合評價 7組大白兔瘡面愈合情況及創(chuàng)面愈合率對比，第7天，a2、a3 組大白兔瘡面干燥，可見大片鮮紅色肉芽組織形成；b組、a1組大白兔瘡面輕微水腫，可見散在粉紅色顆粒狀肉芽組織形成；c組大白兔瘡面仍嚴重水腫、污穢模糊，無肉芽組織形成；d組、e組大白兔瘡面輕微水腫，肉芽色暗淡，周邊角化明顯。 第21天，a2、a3組大白兔瘡面完全愈合；b、a1組大白兔瘡面面積減少，基本愈合；c組大白兔瘡面少量結(jié)痂，部分假性愈合。d、e組瘡面周邊可見少量上皮生長，瘡面面積減少，見表1。

表1 7組大白兔瘡面愈合率比較

2.2組織病理學(xué)變化 不同時間VLUs模型變化見圖1。第1天，炎細胞開始出現(xiàn)，組織水腫明顯，紅細胞明顯，組織細胞結(jié)構(gòu)疏松；第7天，組織水腫開始消退，炎細胞減少，結(jié)締組織開始增生成纖維細胞增多；第21天，組織水腫消失，炎細胞減少明顯幾乎消失，結(jié)締組織增生明顯。

圖1 不同時間VLUs模型病理圖(HE，×400)

第21天HE 染色圖片見圖2。a1，a2，a3組細胞結(jié)構(gòu)排列整齊，成纖維細胞增多明顯，下肢靜脈性潰瘍組細胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，成纖維細胞增多不明顯；成纖維細胞結(jié)構(gòu)增多數(shù)量：a2組>a3組>b組>a1組>e組>d組>c組。

圖2 7組下肢靜脈性潰瘍HE染色結(jié)果(×100)

2.3免疫印跡法檢測結(jié)果 結(jié)果見圖3。①a2組和b組CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白水平最高，d 組含量最低，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與c組及e組比較，a2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。②a2組和b組PCNA、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白水平含量最高，d 組含量最低，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與c組及e組比較，a2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。③a2組Smad7、Caspase3蛋白水平含量最低，d組含量最高，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與c組比較，a2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。④a2組和b組α-SMA蛋白水平含量最高，d組含量最低，與d組比較，a2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A.a1組；B.a2組；C.a3組；D.e組；E.d組；F .c組；G.b組；①與a2組比較，P<0.05。

3 討論

VLUs是周圍血管科常見的疾病，其修復(fù)過程極為復(fù)雜，涉及多種組織和修復(fù)細胞、細胞因子、生長因子和細胞外基質(zhì)等調(diào)控因素的參與。修復(fù)細胞在創(chuàng)傷修復(fù)的過程中占核心位置。成纖維細胞貫穿創(chuàng)面修復(fù)過程始終，在肉芽形成、創(chuàng)面收縮、基質(zhì)合成、傷口修復(fù)等方面均起重要作用[6]，有研究表明，瘡面愈合早期炎癥期主要由單核、巨噬細胞和中性粒細胞等非特異免疫細胞向傷處遷移并釋放多種細胞因子；中期由成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等形成肉芽組織，填補組織缺損，并由表皮細胞增殖、遷移重建皮膚屏障；后期則主要由成纖維細胞分泌并沉積基質(zhì)。這些細胞行為的調(diào)控依賴于細胞因子傳遞信息，改變細胞因子的信息傳遞過程有可能干預(yù)和調(diào)控細胞的行為 。TGF-β1/Smads 通路是 TGF-β主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在組織修復(fù)、細胞外基質(zhì)沉積和組織纖維化等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，介導(dǎo)創(chuàng)面愈合過程[7-8]。

筆者在本研究通過研究VLUs兔成纖維細胞增殖，通過形態(tài)學(xué)觀察，以及Western blotting檢測，紫朱軟膏外用能促進下肢靜脈性潰瘍的愈合速度；紫朱軟膏主要由朱砂、紫草、龍血竭、黃芪、阿膠、冰片六味中藥組成。且這六味具有清熱解毒、祛腐生肌、補氣益血之功效。其中，紫草具有清熱解毒、活血涼血的功效；朱砂外用有解毒生肌之功，用治瘡瘍腫毒，適用于潰瘍久不收口；黃芪、阿膠補益氣血，氣血充足則為創(chuàng)面愈合提供有利條件。諸藥合用共奏煨膿祛瘀、補虛生肌之效；紫朱軟膏治療VLUs，已經(jīng)過大量臨床觀察，療效確切[9]。

通過HE染色檢測不同瘡面組織切片中成纖維細胞的形態(tài)及變化，結(jié)果表明紫朱軟膏組比其他對照組成纖維細胞結(jié)構(gòu)排列整齊，成纖維細胞增多明顯。成纖維細胞是創(chuàng)面愈合過程中的主體細胞，其生物學(xué)效應(yīng)在創(chuàng)面修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，成纖維細胞所合成的膠原是細胞外基質(zhì)的主要組分，膠原代謝的結(jié)果直接影響創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量[10]。紫朱軟膏組成纖維細胞增多，說明外敷紫朱軟膏有促進創(chuàng)面成纖維細胞增殖的功效。

Western blotting法檢測α-SMA 、PCNA、p-Smad2 、 p-Smad3、 Smad7的蛋白水平，結(jié)果與正常對照組比較，TGF-β1處理組細胞增殖明顯，α-SMA蛋白水平增加，Smad2 和Smad3蛋白磷酸化水平顯著增加，Smad7蛋白水平顯著降低，TGF-β和 Smads 蛋白分別是成纖維細胞的趨化因子和下游信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，α-SMA 是成纖維細胞標記物，α-SMA 的表達量可間接反映成纖維細胞的增殖情況[11]。PCNA 屬于真核細胞 DNA 復(fù)制與核苷酸剪切過程中所需要的一種輔助蛋白，可有效評價細胞增殖狀態(tài)[12]。Western blotting法檢測α-SMA與PCNA的含量升高明顯，說明紫朱軟膏外用有促進成纖維細胞增殖的作用。

TGF-β1是目前公認的與潰瘍愈合密切相關(guān)的細胞因子之一，是一類多肽信號分子家族，具有調(diào)節(jié)細胞生長、分化的重要作用[13]。其中TGF-β1是上皮再生、免疫應(yīng)答和造血功能的關(guān)鍵抑制因子，是結(jié)締組織生長的促進因子[14]，可通過自分泌、旁分泌等方式調(diào)節(jié)成纖維細胞的生長和分化，刺激成纖維細胞增殖，促進傷口再上皮化。TGF-β1/Smads通路的激活途徑中，TGF-β1必須與其跨膜受體結(jié)合，才能活化下游效應(yīng)分子進而激活信號傳導(dǎo)，并通過Smads 蛋白將信號由胞質(zhì)介導(dǎo)入胞核，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。p-Smads是Smads分子的活化形式，只有發(fā)生磷酸化后才能傳遞 TG-β1的刺激信號。其中，Smad3的磷酸化是 TGF-β1/Smads信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用的最關(guān)鍵步驟及重要標志[15]，細胞內(nèi) p-Smad3蛋白表達的多少意味著TGF-β/Smads信號通路被激活以及發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的強弱程度[16]。

實驗結(jié)果顯示，紫朱軟膏外用治療VLUs，引起局部組織細胞的增殖加速，很有可能是由于局部 TGF-β1的表達增加所造成，紫朱軟膏通過在蛋白表達水平激活TGF-β/Smads 信號通路，并且伴隨著Smad7表達水平降低，TGF-β1、α-SMA 活化水平升高，表明紫朱軟膏促進成纖維細胞的增殖可能和TGF-β/Smad3信號通路有關(guān)。

綜上所述，紫朱軟膏外用可有效促進VLUs兔子創(chuàng)面的愈合，誘導(dǎo)TGF-β1/Smads表達，促進成纖維細胞的增殖可能是其作用機制之一，有待通過觀察多個相關(guān)蛋白、利用多種實驗方法等進一步證實。