李茜雅 張盛培 李 河

(經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長(zhǎng)沙 410004)

油茶(Camelliaoleifera)樹不僅可以保持水土、涵養(yǎng)水源，而且還能提供優(yōu)質(zhì)的食用油，具有極高的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值(劉躍進(jìn)等， 2007； 陳永忠等， 2013)。由刺盤孢屬(Colletotrichumspp.)真菌導(dǎo)致的炭疽病能造成油茶落葉、落花和落果(靳愛仙等， 2009)。油茶籽產(chǎn)量因炭疽病減產(chǎn)10%～30%，重病區(qū)甚至減產(chǎn)50%以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(徐麗萍等， 2015)。目前，我國(guó)防治油茶炭疽病主要采用苯并咪唑類(多菌靈或甲基托布津等)內(nèi)吸性殺菌劑(鄭少華， 2012)，但由于其作用位點(diǎn)和機(jī)制較為單一，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。而病原菌對(duì)多靶標(biāo)位點(diǎn)的殺菌劑不易產(chǎn)生抗藥性(詹家綏等， 2014)，因此亟需研究篩選出更多新的藥物靶標(biāo)位點(diǎn)，為新型殺菌劑的研發(fā)提供依據(jù)。

Retromer復(fù)合體主要介導(dǎo)跨膜蛋白從內(nèi)涵體到反式高爾基體的運(yùn)輸和從內(nèi)涵體到細(xì)胞膜的運(yùn)輸，使得蛋白受體可以反復(fù)循環(huán)利用，避免運(yùn)輸?shù)饺苊阁w被降解，維持細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡(Bonifacinoetal.， 2008； Hierroetal.， 2007)。該復(fù)合體由液泡分選蛋白(vacuolar protein sorting，簡(jiǎn)稱vps)組成，分為由Vps26、Vps29和 Vps35構(gòu)成的貨物識(shí)別三聚體和由Vps5和Vps17構(gòu)成的微管分選蛋白二聚體(Cullenetal.， 2011)。禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)Retromer復(fù)合體Vps5、Vps17、Vps26、Vps29和 Vps35五個(gè)分選蛋白均參與調(diào)控菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和致病過程(張瑩， 2011)。在稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)Vps26、Vps29和 Vps35組成的貨物識(shí)別三聚體均影響該病菌的產(chǎn)孢量和致病力(鄭文輝， 2014)。

果生刺盤孢(Colletotrichumfructicola)是油茶炭疽病優(yōu)勢(shì)致病菌(李河等， 2014； 2017； 2018； 2019)。筆者課題組從果生刺盤孢全基因組中鑒定到1個(gè)與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的Retromer復(fù)合體亞基Vps26的同源蛋白，命名為CfVps26，但其生物學(xué)功能尚不清楚。本文擬以液泡分選蛋白Vps26為研究對(duì)象，其在油茶果生刺盤孢中的生物學(xué)功能，為探究Vps26的作用機(jī)制和防治油茶炭疽病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

果生刺盤孢CFLH16為野生型菌株，突變體ΔCfvps26和回補(bǔ)菌株ΔCfvps26/CfVPS26由本試驗(yàn)獲得。

1.2 CfVps26蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)釀酒酵母中Vps26蛋白氨基酸序列(XP_031879784.1)在果生刺盤孢全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(ANPB00000000.1)中進(jìn)行搜索，獲得與其同源的CfVps26蛋白氨基酸序列，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他真菌的Vps26蛋白氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3 CfVPS26基因敲除載體構(gòu)建及突變體篩選

以野生型菌株 CFLH16 基因組 DNA 為模板，設(shè)計(jì)引物CfVPS26-1F/CfVPS26-2R、CfVPS26-3F/CfVPS26-4R(表1)分別PCR擴(kuò)增CfVPS26目的基因上下游各1 kb左右的DNA片段，將其作為構(gòu)建敲除載體片段的上下臂。引物 Hyg F/Hyg R(表1)用來擴(kuò)增潮霉素抗性基因片段(HPH)。利用引物CfVPS26-1F/CfVPS26-4R，采用Over-lap方法將上臂、潮霉素和下臂DNA片段順序連接，得到CfVPS26基因敲除載體片段。

參照Zhang等(2019)方法制備果生刺盤孢CFLH16原生質(zhì)體。參考高亞蘭等(2020)的方法將CfVPS26基因敲除載體片段轉(zhuǎn)化至原生質(zhì)體中。采用基因內(nèi)探針引物CfVPS26-7F/CfVPS26-8R和基因外引物CfVPS26-5F/H855R(表1)驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子?；騼?nèi)探針引物不能擴(kuò)增出目的基因條帶，且基因外引物可擴(kuò)增出正確大小條帶的轉(zhuǎn)化子為CfVPS26基因敲除突變體。

表1 CfVPS26在果生刺盤孢研究中使用的引物Tab.1 CfVPS26 primers used in Colletotrichum fructicola study

1.4 CfVPS26基因敲除突變體回補(bǔ)菌株的獲得

采用引物CfVPS26-9F/CfVPS26-10R PCR擴(kuò)增含有啟動(dòng)子在內(nèi)的CfVPS26基因回補(bǔ)片段，參照高亞蘭等(2020)方法構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒； 將回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至突變體ΔCfvps26原生質(zhì)體中，在添加博來霉素的TB3培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 天，熒光篩選回補(bǔ)菌株。

1.5 突變體ΔCfvps26的表型測(cè)定

1.5.1 不同種類培養(yǎng)基上生長(zhǎng)測(cè)定 參照姚權(quán)等(2019)方法對(duì)菌株的生長(zhǎng)速率進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 細(xì)胞壁敏感性測(cè)定 在野生型、突變體和回補(bǔ)菌株菌落邊緣用無菌打孔器(Φ=8 mm)切取菌餅，分別接種含0.01%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和200 μg·mL-1熒光增白劑(calcofluor white，CFW)的PDA平板上，培養(yǎng)3天后測(cè)量菌落直徑。

1.5.3 產(chǎn)孢量與附著胞形成測(cè)定 將野生型、突變體和回補(bǔ)菌株菌落分別接種在PDB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 天后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量。得到等濃度(105個(gè)·mL-1)分生孢子懸浮液，滴加10 μL 置于疏水玻片上，保濕培養(yǎng)12 h后觀察記錄附著胞形成率情況。

1.5.4 致病力測(cè)定 在培養(yǎng)3天的野生型、突變體和回補(bǔ)菌株菌落邊緣用無菌打孔器(Φ=8 mm)切取菌餅，將菌餅有菌絲的一面接種油茶葉片上，空白PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。保濕培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況并統(tǒng)計(jì)直徑。

1.5.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力脅迫劑敏感性測(cè)定 在野生型、突變體和回補(bǔ)菌株菌落邊緣用經(jīng)滅菌的打孔器(Φ=8 mm)切取菌餅，接種于含5 mmol·L-1二硫蘇糖醇DTT的PDA平板上，培養(yǎng)4 天，測(cè)量菌落直徑。

1.5.6 糖原染色 參照鄭文輝(2014)的方法對(duì)附著胞進(jìn)行糖原染色，制備濃度為105個(gè)·mL-1的野生型CFLH16和突變體ΔCfvps26分生孢子懸浮液，各取10 μL滴于疏水玻片上黑暗保濕培養(yǎng)24 h，吸取多余水分后滴加30 μL糖原染料(I2/KI，120 mg·mL-1KI + 20 mg·mL-1I2)，黑暗靜止染色30 min，顯微鏡觀察附著胞糖原代謝情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 CfVps26的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

鑒定到1個(gè)與釀酒酵母中Retromer復(fù)合體亞基Vps26同源的蛋白CfVps26，對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，從第5～279個(gè)氨基酸僅有1個(gè)Vps26結(jié)構(gòu)域(圖1A)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明果生刺盤孢中Vps26氨基酸序列與希金斯刺盤孢(C.higginsianum)親緣關(guān)系最近，與釀酒酵母親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖1B)。

圖1 CfVps26結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Domain and phylogenetic analysis of CfVps26A: CfVps26蛋白的結(jié)構(gòu)域。B: 鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。A: The structure of CfVps26； B: Phylogenetic tree was constructed by neighbor joining method.

2.2 CfVPS26基因敲除突變體及回補(bǔ)菌株的獲得

根據(jù)同源重組原理構(gòu)建CfVPS26基因敲除策略(圖2A)。利用引物CfVPS26-7F/CfVPS26-8R和CfVPS26-5F/H855R進(jìn)行驗(yàn)證，獲得突變體ΔCfvps26?；匮a(bǔ)菌株ΔCfvps26/CfVPS26通過熒光篩選以及PCR驗(yàn)證獲得(圖2B)。

圖2 獲得CfVPS26基因敲除突變體Fig. 2 Generation of the CfVPS26 gene deletion mutantA: 基因敲除策略圖; B: 電泳驗(yàn)證圖。A: Schematic of the deletion strategy; B: Electrophoregram for verification.

2.3 CfVPS26參與調(diào)控果生刺盤孢營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和附著胞形成

突變體ΔCfvps26在PDA和MM培養(yǎng)基上，菌落直徑均小于野生型及回補(bǔ)菌株(圖3A)，統(tǒng)計(jì)分析差異顯著(圖3B)，氣生菌絲明顯減少(圖3C)，說明CfVPS26能夠調(diào)控果生刺盤孢菌體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。

圖3 CfVPS26基因敲除突變體的菌絲生長(zhǎng)測(cè)定和產(chǎn)孢量、附著胞形成率統(tǒng)計(jì)分析Fig. 3 Growth defect, statistical analysis of conidial quantity and appressorium formation rate of CfVPS26 gene deletion mutantA： 突變體在PDA、MM 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況； B： 直徑統(tǒng)計(jì)； C： 菌落側(cè)視圖； D: 突變體ΔCfvps26能形成少量附著胞； E:產(chǎn)孢量統(tǒng)計(jì)； F:附著胞形成率。 不同小寫字母表示不同菌株間差異極顯著(P≤0.01)。下同。A: Growth of ΔCfvps26 strain inoculated on PDA and MM media; B: Diameter； C: Lateral views; D: The ΔCfvps26 can form a small amount appressorium; E: Conidiation; F: Appressorium formation rate. Different small letters indicate significan difference between different strains(P≤0.01)． The same below.

對(duì)野生型菌株CFLH16、突變體ΔCfvps26以及回補(bǔ)菌株ΔCfvps26/CfVPS26的產(chǎn)孢量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)突變體菌株ΔCfvps26產(chǎn)孢量顯著下降，只有野生型和回補(bǔ)菌株產(chǎn)孢量的10%左右(圖3E)。附著胞是病原真菌侵染植物組織的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。對(duì)野生型菌株CFLH16、突變體ΔCfvps26以及回補(bǔ)菌株ΔCfvps26/CfVPS26的附著胞形成率統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與野生型和回補(bǔ)菌株相比，突變體ΔCfvps26附著胞形成率顯著下降(圖3D)，且差異顯著(圖3F)。以上結(jié)果說明CfVPS26基因參與調(diào)控果生刺盤孢分生孢子及附著胞的形成，這可能是突變體ΔCfvps26對(duì)油茶葉片致病力顯著降低的主要原因。

2.4 CfVPS26參與調(diào)控果生刺盤孢對(duì)外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答

真菌在生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中會(huì)受到多種外界環(huán)境脅迫的影響，進(jìn)一步研究CfVPS26基因是否響應(yīng)細(xì)胞壁脅迫應(yīng)答，將野生型菌株CFLH16、突變體ΔCfvps26和回補(bǔ)菌株ΔCfvps26/CfVPS26分別接種于含有細(xì)胞壁抑制劑CFW和SDS的 PDA培養(yǎng)基上，比較生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，突變體ΔCfvps26對(duì)CFW和SDS敏感性增強(qiáng)，其生長(zhǎng)抑制率高于野生型和回補(bǔ)菌株，且差異顯著(圖4A、B)，說明CfVPS26基因參與果生刺盤孢對(duì)細(xì)胞壁脅迫應(yīng)答。

為確定CfVPS26基因是否參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力脅迫應(yīng)答過程，將野生型菌株CFLH16、突變體菌株ΔCfvps26和回補(bǔ)菌株ΔCfvps26/CfVPS26分別接種于含有5 mmol·L-1二硫蘇糖醇DTT的PDA培養(yǎng)基上，比較生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果表明，突變體菌株ΔCfvps26對(duì)DTT耐受性顯著高于野生型菌株和回補(bǔ)菌株(圖4C、D)，說明CfVPS26基因負(fù)調(diào)控果生刺盤孢應(yīng)答內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力脅迫過程。

圖4 突變體ΔCfvps26參與外界環(huán)境脅迫應(yīng)答Fig. 4 Growth assays of the ΔCfvps26 mutant on PDA with environmental stressorsA： 突變體ΔCfvps26在細(xì)胞壁脅迫下的生長(zhǎng)情況； B： 抑制率統(tǒng)計(jì)； C:突變體ΔCfvps26在DTT脅迫下的生長(zhǎng)情況； D： 抑制率統(tǒng)計(jì)。A: Growth of ΔCfvps26 under cell wall stress； B: Inhibition rates; C: Growth of ΔCfvps26 under DTT stress; D: Inhibition rates.

2.5 CfVPS26基因參與調(diào)控果生刺盤孢的致病力

對(duì)突變體ΔCfvps26、野生型和回補(bǔ)菌株進(jìn)行了致病力測(cè)定，結(jié)果顯示，在離體接種3天后，與野生型和回補(bǔ)菌株相比突變體ΔCfvps26沒有產(chǎn)生病斑，喪失了對(duì)油茶葉片的致病力(圖5A、B)。以上結(jié)果說明CfVPS26基因參與調(diào)控果生刺盤孢的致病力。

圖5 突變體ΔCfvps26對(duì)油茶葉片的致病力測(cè)定Fig. 5 Pathogenicity of ΔCfvps26 to oil-tea leavesA： 野生型、突變體ΔCfvps26和回補(bǔ)菌株接種在有傷葉片上； B： 病斑統(tǒng)計(jì)。A: CFLH16, ΔCfvps26 and ΔCfvps26/CfVPS26 were inoculated onto wounded leaves; B: Lesion diameter．

2.6 CfVPS26基因參與調(diào)控果生刺盤孢糖原代謝

附著胞內(nèi)膨壓的形成來源于甘油的積累。分生孢子的萌發(fā)后，糖原物質(zhì)會(huì)逐漸從分生孢子向附著胞轉(zhuǎn)移，隨后發(fā)生降解進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)楦视?Wangetal.， 2005)。本試驗(yàn)利用糖原染色劑I2/KI對(duì)分生孢子及附著胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，野生型菌株分生孢子和附著胞糖原已經(jīng)幾乎代謝完全，而突變體ΔCfvps26中仍然有大量的糖原存在(圖6)，說明突變體中糖原代謝受阻。結(jié)果表明，CfVPS26基因參與調(diào)控果生刺盤孢的糖原代謝過程。

圖6 糖原染色Fig. 6 Staining for glycogen

3 討論

3.1 CfVPS26基因與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的關(guān)系

菌絲是絲狀真菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的主要模式，侵染菌絲可以在寄主組織內(nèi)擴(kuò)展定殖。VPS26基因參與調(diào)控植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)，張瑩(2011)研究發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中VPS26基因敲除突變體生長(zhǎng)速率減慢、氣生菌絲明顯減少。本研究發(fā)現(xiàn)，果生刺盤孢的CfVPS26基因敲除后，突變體ΔCfvps26菌絲生長(zhǎng)速率減慢，氣生菌絲量也顯著少于野生型和回補(bǔ)菌株。但黃清平(2013)研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中的VPS26基因敲除后，其菌絲形態(tài)和生長(zhǎng)速率則無明顯變化。因此VPS26基因在調(diào)控不同病原菌的菌絲生長(zhǎng)時(shí)作用并不完全相同。

3.2 CfVPS26基因與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的關(guān)系

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成和分泌的重要場(chǎng)所，其穩(wěn)態(tài)平衡在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)擔(dān)過重或壓力過大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，此時(shí)，細(xì)胞便會(huì)通過非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)來恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。湯蔚(2015)研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟菌的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子Hac1和跨膜蛋白激酶IRE1均參與調(diào)控病菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明，果生刺盤孢CfHAC1基因敲除突變體對(duì)5 mmol·L-1二硫蘇糖醇耐受性下降，說明轉(zhuǎn)錄因子CfHac1正調(diào)控病菌對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力脅迫應(yīng)答過程(李司政等， 2020)。而本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)果生刺盤孢的CfVPS26基因敲除突變體ΔCfvps26對(duì)5 mmol·L-1二硫蘇糖醇耐受性增強(qiáng)，說明該基因在應(yīng)答二硫蘇糖醇造成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，但其調(diào)控分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 CfVPS26基因與分生孢子產(chǎn)生的關(guān)系

植物病原真菌的分生孢子作為初侵染與再侵染的接種體，借氣流傳播從寄主表皮直接侵入致病。VPS26基因參與了植物病原真菌分生孢子的形成，對(duì)稻瘟病菌中基因VPS26進(jìn)行敲除后，突變體菌株分生孢子產(chǎn)量顯著下降(黃清平， 2013)。而禾谷鐮刀菌中VPS26基因敲除突變體則幾乎不產(chǎn)孢或產(chǎn)生畸形孢子(張瑩， 2011)。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)果生刺盤孢的突變體菌株ΔCfvps26的分生孢子產(chǎn)量也顯著下降。另外，筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，果生刺盤孢中CfPMK1、CfHAC1、CfMKK1等基因均參與調(diào)控分生孢子的形成過程(李河， 2018； 姚權(quán)等， 2019； 肖宇等， 2021)，說明在果生刺盤孢中存在多種基因參與調(diào)控分生孢子的形成這一過程。

3.4 CfVPS26基因與附著胞發(fā)育的關(guān)系

附著胞是侵染寄主的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)(Bechingeretal.,1999)。Kitade等(2015)研究發(fā)現(xiàn)玉米(Zeamays)小斑病菌(Bipolarismaydis)的STE7基因參與調(diào)控附著胞的形成。在膠胞刺盤胞(C.gloeosporioides)中的CgRGS7基因也影響了附著胞的形成過程(吳曼莉等， 2017)。前期對(duì)果生刺盤孢的研究發(fā)現(xiàn)，CfPMK1、CfSNF1和CfMKK1基因缺失突變體都不能形成附著胞(李河， 2018； Zhangetal., 2019； 肖宇等， 2021)。在本研究發(fā)現(xiàn),突變體ΔCfvps26附著胞形成率顯著降低，這可能是導(dǎo)致其致病力喪失的原因之一。然而黃清平(2013)的研究發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌中突變體ΔMoVps26對(duì)分生孢子的萌發(fā)和附著胞形成并無決定性作用，說明VPS26基因在不同的病原菌種類中功能存在差異。

3.5 附著胞發(fā)育與糖原代謝的關(guān)系

附著胞正常的膨壓對(duì)病原菌侵入寄主十分重要(Jongetal., 1997)。膨壓的產(chǎn)生需要大量甘油的累積，它來源于分生孢子內(nèi)的糖原等能源物質(zhì)，通過芽管運(yùn)輸至附著胞降解形成甘油(Wangetal., 2005； Talbot， 2003)。在希金斯刺盤孢中，ChODC基因參與調(diào)控附著胞中糖原的轉(zhuǎn)移過程(嚴(yán)亞琴， 2020)。稻瘟病菌中基因MoEND3和MoCRN的缺失會(huì)導(dǎo)致糖原轉(zhuǎn)移和降解非常緩慢(李瀟， 2017)。在本研究中，果生刺盤孢野生型菌株CFLH16的糖原隨著附著胞發(fā)育成熟而逐漸代謝，而突變體ΔCfvps26分生孢子中仍有糖原滯留，附著胞內(nèi)糖原代謝顯著減慢，說明糖原在突變體ΔCfvps26中的代謝受到了限制。由此推測(cè)CfPVS26基因參與了糖原的代謝過程，其敲除突變體不能形成正常的附著胞膨壓，進(jìn)而喪失了對(duì)油茶葉片的致病力。

4 結(jié)論

本研究在油茶果生刺盤孢中鑒定到1個(gè)Retromer逆向囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體亞基蛋白CfVps26，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白參與調(diào)控病菌生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)孢、附著胞形成、糖原代謝、外界脅迫應(yīng)答和致病過程，研究結(jié)果有助于揭示果生刺盤孢致病的分子機(jī)制，并為開發(fā)殺菌劑提供潛在藥靶。