涼血通瘀方對(duì)腦出血大鼠腦組織TLR4和NF-κB p65的影響

王君君，李建香，張子健，過偉峰*

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210023）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種原發(fā)性非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，在我國(guó)約占全部卒中患者的20%～30%［1］，急性期病死率約30%～40%，預(yù)后不良，甚則致殘。腦出血后數(shù)分鐘即可產(chǎn)生血腫占位，顱內(nèi)壓升高，繼而出現(xiàn)低灌注，浸潤(rùn)組織產(chǎn)生炎性反應(yīng)［2］。國(guó)醫(yī)大師周仲瑛創(chuàng)立的涼血通瘀方具有通腑泄熱、涼血化瘀之功效，筆者應(yīng)用此方治療急性腦出血，前期臨床研究觀察證實(shí)其有助于改善神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征，減輕病情，改善預(yù)后［3］，實(shí)驗(yàn)研究有抗炎效應(yīng)［4］。本研究采用涼血通瘀方干預(yù)腦出血大鼠模型，觀察其對(duì)腦組織TLR4 和NF-κB p65 的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性成年SD大鼠24只，體質(zhì)量220～300 g，購(gòu)自江蘇省青龍山動(dòng)物繁育中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001。置于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)：5只大鼠為一籠，不限制飲水、攝食，給予恒溫恒濕、12 h光照與12 h黑暗交替環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，批準(zhǔn)號(hào)為：201905A041。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

涼血通瘀方藥組成：熟大黃10 g，水牛角（先煎）30 g，生地黃20 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g和石菖蒲10 g，購(gòu)自安徽滬春堂中藥飲片有限公司。制成每毫升含1.1 g鮮藥的水煎劑藥液，放置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

蛋白酶抑制劑混合物（貨號(hào)：P1005）、裂解液（貨號(hào)：P0013B）、PMSF（貨號(hào)：ST505）、蛋白Marker（貨號(hào)：P0075）、4 × 上樣緩沖液、BCA 蛋白濃度測(cè)定（貨號(hào)：P0010S）、β-巰基乙醇（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；過硫酸銨、Tween-20（北京索萊寶科技有限公司）；TLR4 抗體（貨號(hào)：ab217274）、羊抗兔IgG H&L 二抗（貨號(hào)：ab6721）、內(nèi)參抗體（貨號(hào)：ab181602）［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］；SYBR Premix Ex Taq，RT Master Mix（日本Takara 公司）；TLR4、GAPDH 引物（上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

注射泵控制器（型號(hào)TJ-1A，保定蘭格恒流泵有限公司）；腦立體定位儀（型號(hào)990-685，加拿大David Kopf Instruments 公司）；多功能開顱鉆（型號(hào)Thakita 6222D，日本Makita 公司）；50 μL 微量進(jìn)樣器（上海光正醫(yī)療儀器）；電子天平（型號(hào)：CPA1003P，德國(guó)Sartorius）；酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer，型號(hào)：PE）；球磨儀（Retsch，型號(hào)：MM400）；微型垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad，型號(hào)Min i-Protoan T cua）；蛋白半干轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad，型號(hào)：170-3940）；離心機(jī)（Eppendorf，型號(hào)：5417R）；超靈敏發(fā)光成像儀（GE，型號(hào)：LAS4000）；振蕩器（海門其林貝爾，型號(hào)：vortex-5）；7500 Real Time PCR儀（ABI 公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模及給藥

在動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將24 只健康成年SD 大鼠隨機(jī)分成正常組、假手術(shù)組、模型組和涼血通瘀組，共4 組，每組6 只。模型組和涼血通瘀組采用注射泵控制器注血/二次退針法制作腦出血模型［5］：調(diào)整立體定向儀，使門齒鉤低于耳間線2.4 mm；麻醉仰臥固定，頭部正中切開，定位右側(cè)尾狀核（前囟點(diǎn)右側(cè)中線旁開3 mm、冠狀縫前0.2 mm），鉆孔；翻轉(zhuǎn)分離尾動(dòng)脈，微量進(jìn)樣器穿刺抽血50 μL，固定于立體定位儀，顱骨表面與進(jìn)針相距6 mm，注射泵以10 min勻速注血50 μL，留針10 min，退針2 mm，再留針5 min，緩慢退針，無菌骨蠟封閉，縫合皮膚。

按照Longa五級(jí)評(píng)分法［6］進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，1～3分表示造模成功。假手術(shù)組同樣定位后置入空針，不注血。涼血通瘀組按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體臨床用藥劑量換算公式所得劑量，灌胃涼血通瘀方水劑（1.0 mL/100 g）。假手術(shù)組、模型組每日給予等劑量蒸餾水灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃3 d后取材。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 行為學(xué)評(píng)分

按照Longa 五級(jí)評(píng)分法［6］測(cè)評(píng)大鼠神經(jīng)功能缺損程度，再由2 名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的研究人員對(duì)大鼠評(píng)分，計(jì)算平均分［7］。

2.2.2 腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

采用Western Blot 法，加入RIPA 裂解液，使用球磨儀勻漿收集大腦總蛋白，采用BCA 試劑盒、酶標(biāo)儀定量蛋白濃度，以GAPDH 為內(nèi)參。室溫下配置10%SDS-PAGE，待膠凝固后加入樣本，進(jìn)行電泳及半干轉(zhuǎn)。用脫脂奶粉配置濃度為5%的封閉液，4 ℃條件下孵育一抗過夜，室溫孵育二抗2 h，配置曝光反應(yīng)液，運(yùn)用超靈敏發(fā)光成像儀進(jìn)行蛋白條帶成像及檢測(cè)，ImageJ軟件進(jìn)行計(jì)算和分析相對(duì)蛋白灰度值。

2.2.3 腦組織TLR4 mRNA的表達(dá)

采用RT-PCR 法，取5 mm3左右大小的大鼠腦組織放置于研磨管中，加入研磨鋼珠，按50 mg 組織/mL加入Trizol 裂解細(xì)胞，提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)腦組織RNA 濃度及純度。以逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書為標(biāo)準(zhǔn)配制反應(yīng)體系，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。處理逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物，設(shè)定PCR 反應(yīng)程序，使用7500 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參，利用2-△△CT公式計(jì)算目的基因表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)分析，滿足正態(tài)分布，則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析。P≤0.05即為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較

與正常組比較，模型組、涼血通瘀組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，涼血通瘀組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.01）。具體見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（±s，分）

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較（±s，分）

注：與正常組比較，$$P ＜0.01；與假手術(shù)組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01。

組別正常組假手術(shù)組模型組涼血通瘀組n6 6 6 6 Longa五級(jí)評(píng)分0 0 1.667±0.516$$**1.167±0.408$$**##

3.2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)皆明顯升高（P＜0.01），涼血通瘀組NF-κB p65蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，涼血通瘀組大鼠腦組織TLR4蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01），NF-κB p65 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。具體見表2。各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65電泳圖見圖1。

表2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)（±s，灰度值）

表2 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)（±s，灰度值）

注：與正常組比較，$$P ＜0.01；與假手術(shù)組比較，**P ＜0.01，*P ＜0.05；與模型組比較，##P ＜0.01，#P ＜0.05。

組別正常組假手術(shù)組模型組涼血通瘀組n6 6 6 6 TLR4 0.174±0.928 0.278±0.202 0.633±0.147$$*0.259±0.025##NF-κB p65 0.472±0.712 0.572±0.186 1.106±0.212$$**0.762±0.210$#

圖1 各組大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65蛋白電泳圖

3.3 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達(dá)

引物設(shè)計(jì)見表3。與正常組、假手術(shù)組及涼血通瘀組比較，模型組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.01），涼血通瘀組與正常組及假手術(shù)組未見明顯差異，見表4。

表3 引物設(shè)計(jì)

表4 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達(dá)（±s）

表4 各組大鼠腦組織TLR4 mRNA的表達(dá)（±s）

注：與正常組比較，$$P ＜0.01；與假手術(shù)組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01。

組別正常組假手術(shù)組模型組涼血通瘀組n6 6 6 6 TLR4 mRNA 1.000±0.000 1.242±0.466 2.242±0.481$$**1.495±0.235##

4 討論

腦出血屬“中風(fēng)”范疇。卒中后便秘發(fā)生率達(dá)29%～76%，腦出血更為常見［8-9］。大腸具傳導(dǎo)水谷糟粕之功，如果大腸傳導(dǎo)失司，陽(yáng)明熱盛，導(dǎo)致熱邪與腸內(nèi)燥屎相結(jié)，則濁氣上擾，引發(fā)神志癥狀。周老認(rèn)為本病的主要病機(jī)系瘀熱，并據(jù)此創(chuàng)立涼血通瘀方，以涼血化瘀、通腑泄熱為效［10-11］。組方以大黃通腑瀉熱化瘀、水牛角涼血清熱，兩藥合用重在涼血通瘀；生地黃涼血清熱，佐以赤芍、牡丹皮，加強(qiáng)涼血活血散瘀之功效；石菖蒲豁痰開竅，引藥上行。本方重在瀉熱通瘀，順調(diào)氣血，給邪以出路，達(dá)到以腸治腦之功效。

TLR4/NF-κB 是腦出血損傷后重要的炎癥信號(hào)通路，NF-κB是炎癥信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，腦出血發(fā)生后迅即出現(xiàn)NF-κB活化［12］，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)；炎性細(xì)胞因子又是NF-κB的激活物，所以當(dāng)NF-κB激活引起炎癥反應(yīng)，則會(huì)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)，加重腦損害［13］。TLR4是關(guān)鍵跨膜蛋白，將細(xì)胞外抗原識(shí)別系統(tǒng)向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng)［14］。PEREZPARDO P［15］提示TLR4介導(dǎo)的炎性損傷在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦腸炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TLR4信號(hào)傳導(dǎo)可通過下游因子激活NF-κB信號(hào)通路，啟動(dòng)與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，以誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)［16］，從而放大炎癥效應(yīng)，參與腦出血引發(fā)的繼發(fā)性炎性損傷［17］。

TLR4的升高導(dǎo)致腦出血預(yù)后不容樂觀，下降則有助于改善腦出血的預(yù)后［18］。本研究結(jié)果顯示，涼血通瘀方干預(yù)后腦出血大鼠的TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)及TLR4 mRNA表達(dá)降低，證實(shí)涼血通瘀方可抑制TLR4和NF-κB表達(dá)，從而證明涼血通瘀方有助于減輕腦炎癥損傷，使腦出血的預(yù)后得以改善。鑒于中藥復(fù)方的作用靶點(diǎn)多，本實(shí)驗(yàn)研究?jī)H在蛋白、基因水平證實(shí)涼血通瘀方抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路以減輕腦損害，尚有待進(jìn)一步進(jìn)行更深入的研究。