紅茶菌對(duì)阿司匹林致大鼠胃潰瘍的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

李先行，杜昊炎，馮志海*

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2. 商丘市中醫(yī)院，河南 商丘 476000）

胃潰瘍（gastric ulcer，GU）是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病之一，常因非甾體抗炎藥、急性應(yīng)激、幽門螺桿菌感染、胃酸和胃蛋白酶分泌及胃運(yùn)動(dòng)異常等多種因素引起，病程較長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率較高［1-2］。阿司匹林是傳統(tǒng)的解熱鎮(zhèn)痛藥，也是一種非甾體抗炎藥，其主要的不良反應(yīng)是降低胃黏膜保護(hù)功能，導(dǎo)致消化性潰瘍的產(chǎn)生［3］。在心血管疾病的預(yù)防和治療方面，長(zhǎng)期、小劑量應(yīng)用阿司匹林逐漸增多，由于長(zhǎng)期使用所產(chǎn)生的消化系統(tǒng)不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［4］。紅茶菌是茶、糖、水加醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多種菌種發(fā)酵后生成的一種茶飲料，可以抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，紅茶菌是一種具有特殊的營(yíng)養(yǎng)保健作用和獨(dú)特飲用風(fēng)味的飲品［5］，用于高血壓、冠心病、失眠及多種胃腸消化系統(tǒng)疾病的治療。大量研究證實(shí)，紅茶菌能夠幫助消化，治療多種胃病，但其是否對(duì)阿司匹林所致的胃潰瘍有保護(hù)作用尚不清楚。本研究旨在探討紅茶菌對(duì)阿司匹林誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠的治療作用及相關(guān)機(jī)制，為紅茶菌在胃潰瘍中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取4～6周齡，清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（180 ± 20）g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（豫）2015-0004。本研究所有大鼠均飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由采食飲水。

1.2 藥物與試劑

紅茶菌發(fā)酵原液（太原紅茶菌生物科技有限公司）；阿司匹林（廣州萬利達(dá)化工商行）；奧美拉唑膠囊（悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；生理鹽水（山東科倫藥業(yè)有限公司）；多聚甲醛固定液（上海尚寶生物科技有限公司）；無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；二甲苯（煙臺(tái)市雙雙化工有限公司）；蘇木素染色液（福州飛凈生物科技有限公司）；伊紅染色液（福州飛凈生物科技有限公司）；胃泌素測(cè)定試劑盒（美國(guó)BD 公司）；胃蛋白酶測(cè)定試劑盒（美國(guó)BD公司）。

1.3 動(dòng)物分組與模型制備

將40 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、奧美拉唑組、胃潰瘍模型組和紅茶菌組，每組10 只。由人鼠換算公式可知，紅茶菌給藥劑量（口服劑量）大鼠為0.54 mL/（200 g·d）［換 算 為 人 給 藥 劑 量 為30 mL/70 kg·d）］，即2.7 mL（原液）/（kg·d），故紅茶菌組大鼠按2.7 mL（原液）/kg（54%的紅茶菌5 mL/kg）灌胃紅茶菌，1 次/d，連續(xù)14 d；奧美拉唑給藥劑量（口服劑量）大鼠為0.72 mg/（200 g·d）［換算為人給藥劑量為40 mg/（70 kg·d）］，即3.6（mg/kg·d），故奧美拉唑組大鼠按3.6 mg/kg（0.072%的奧美拉唑5 mL/kg）灌胃奧美拉唑，1 次/d，連續(xù)14 d。給藥第9 天，除對(duì)照組外，其余各組灌胃阿司匹林（200 mg/kg）造模，1 次/d，連續(xù)5 d。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 胃泌素含量測(cè)定

各組大鼠均在末次給藥1 h 后，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血，經(jīng)離心取血清，用大鼠胃泌素測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中胃泌素含量，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4.2 胃蛋白酶含量測(cè)定

各組大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯1 g/kg 進(jìn)行麻醉后進(jìn)行幽門結(jié)扎，剪取胃，采集賁門少量胃液，采用大鼠胃蛋白酶測(cè)定試劑盒檢測(cè)胃液中胃蛋白酶含量。

1.4.3 胃液pH值測(cè)定

在胃大彎側(cè)剖開各組大鼠胃腔，使用蒸餾水沖洗胃腔，然后收集液體，使用3 000 r/min 離心取上清，采用筆試酸度計(jì)測(cè)定胃液的pH值。

1.4.4 胃黏膜形態(tài)觀察

各組大鼠均采用冰生理鹽水對(duì)胃表面進(jìn)行沖洗，然后將胃組織置于4%中性甲醛中，固定10 min，將胃黏膜展平（胃黏膜面朝上），觀察胃黏膜表面的損傷及出血情況。

1.4.5 胃黏膜組織學(xué)觀察

將胃黏膜展平，肉眼觀察可見胃潰瘍處為中心，對(duì)胃壁組織進(jìn)行修整，以胃長(zhǎng)軸的最長(zhǎng)徑為中心做病理取材，切取胃組織（1 cm×1 cm）；若胃黏膜處無潰瘍，則取相同部位的胃組織（1 cm×1 cm）。將胃組織固定于4%中性甲醛，使用不同梯度的乙醇進(jìn)行脫水后二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋，切片（厚度5 μm），然后進(jìn)行HE 染色，封片，最后置光學(xué)顯微鏡下觀察胃部潰瘍組織病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均使用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組組間比較，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組為正常大鼠的胃黏膜，其表面呈現(xiàn)淡粉色，外觀光滑完整，無明顯出血點(diǎn)；胃潰瘍模型組大鼠胃黏膜紅腫，可見潰瘍面，且呈深褐色，并伴有大量點(diǎn)狀及索狀出血點(diǎn)；奧美拉唑組（陽性組）和紅茶菌組（治療組）大鼠的胃黏膜與模型組比較，均較完整，胃黏膜無明顯充血與水腫，且出血點(diǎn)數(shù)量也明顯減少。具體見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜形態(tài)學(xué)比較

2.2 各組大鼠胃黏膜組織學(xué)觀察

各組大鼠胃黏膜病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠的胃上皮結(jié)構(gòu)完整，層次清楚且連續(xù)性好，胃腺排列整齊，厚薄均勻，未見血管擴(kuò)張及炎癥反應(yīng)；模型組有嚴(yán)重胃上皮脫落現(xiàn)象，胃腺組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，且胃腺周圍聚集大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死的滲出物；經(jīng)奧美拉唑和紅茶菌治療后，兩組大鼠胃腺較模型組明顯改善，損傷程度減輕，排列較整齊，且未見明顯的出血及壞死現(xiàn)象，結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織學(xué)比較（HE，×200）

2.3 各組大鼠胃液pH值測(cè)定

模型組與對(duì)照組比較，模型組大鼠胃液pH值較顯著升高（P＜0.05）；奧美拉唑組、紅茶菌組與模型組比較，紅茶菌組大鼠胃液pH 值較奧美拉唑組顯著降低（P＜0.05）；奧美拉唑組、紅茶菌組與對(duì)照組比較，奧美拉唑組和紅茶菌組大鼠胃液pH值較對(duì)照組降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠胃液pH值比較（±s）

表1 各組大鼠胃液pH值比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.01；與胃潰瘍模型組比較，#P ＜0.01。

組別對(duì)照組胃潰瘍模型組奧美拉唑組紅茶菌組n 10 10 10 10給藥劑量0 0 3.6 mg/kg 2.7 mL/kg pH值3.04±0.65 2.22±0.34*3.06±0.51#3.02±0.51#

2.4 各組大鼠胃蛋白酶含量測(cè)定

模型組與對(duì)照組比較，模型組大鼠胃蛋白酶水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；奧美拉唑組、紅茶菌組與模型組比較，奧美拉唑組和紅茶菌組大鼠胃蛋白酶水平降低（P＜0.01）；奧美拉唑組、紅茶菌組與對(duì)照組比較，奧美拉唑組和紅茶菌組大鼠胃蛋白酶水平降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠胃蛋白酶含量比較（±s）

表2 各組大鼠胃蛋白酶含量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.01；與胃潰瘍模型組比較，#P ＜0.01。

組別對(duì)照組胃潰瘍模型組奧美拉唑組紅茶菌組n 10 10 10 10給藥劑量（g/kg）0 0 0.36 5.4胃蛋白酶含量（ng/mL）13.68±0.61 30.08±1.15*14.06±1.15#15.10±1.21

2.5 各組大鼠胃泌素含量測(cè)定

模型組與對(duì)照組比較，模型組大鼠胃泌素水平顯著升高（P＜0.01）；奧美拉唑組、紅茶菌組與模型組比較，奧美拉唑組和紅茶菌組大鼠胃泌素水平顯著降低（P＜0.01）；奧美拉唑組、紅茶菌組與對(duì)照組比較，奧美拉唑組和紅茶菌組大鼠胃胃泌素水平降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠胃泌素含量比較（±s）

表3 各組大鼠胃泌素含量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.01；與胃潰瘍模型組比較，#P ＜0.01。

組別對(duì)照組胃潰瘍模型組奧美拉唑組紅茶菌組n 10 10 10 10給藥劑量（g/kg）0 0 0.36 5.4胃蛋白酶含量（ng/mL）26.62±1.55 31.10±2.08*26.54±2.00#27.04±2.08#

3 討論

GU是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病之一，其機(jī)制主要與胃黏膜損害因素和黏膜自身防御-修復(fù)因素之間失衡有關(guān)，其中非甾體類藥物是導(dǎo)致胃黏膜防御能力下降及胃黏膜損傷的常見原因。阿司匹林是一種廣泛應(yīng)用于臨床的非甾體類抗炎藥，口服誘發(fā)胃潰瘍的概率高達(dá)10%～20%，這在很大程度上限制了阿司匹林的臨床應(yīng)用［6-8］。臨床上常以?shī)W美拉唑等抗?jié)兯幬飦碇委煱⑺酒チ忠鸬奈笣?，但常常?huì)引起低鎂血癥、皮膚損害及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的不良反應(yīng)［9］，故能夠減輕阿司匹林所致的胃潰瘍且不良反應(yīng)少的藥物研究具有重要意義。

紅茶具有暖胃養(yǎng)生、提神益思、消除水腫、止瀉、抗菌、增強(qiáng)免疫力的功效，紅茶菌是紅茶的加工制品，是由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌發(fā)酵而成的天然微生態(tài)制劑，菌液中含有茶葉浸出物、微生物及其代謝產(chǎn)物，還有人體必需的鈣、鎂、鉀、鈉、磷等礦物質(zhì)，其藥用價(jià)值和保健功能已得到了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的肯定［10］。有研究表明，紅茶菌具有抗氧化、助消化、調(diào)節(jié)腸胃及分泌腺等功能［11-12］。本實(shí)驗(yàn)研究了紅茶菌對(duì)非甾體類抗炎藥致胃潰瘍的保護(hù)作用，結(jié)果顯示紅茶菌組大鼠胃黏膜形態(tài)較為完整，損傷深度程度較輕，排列整齊，表明紅茶菌能有效抑制阿司匹林對(duì)大鼠胃黏膜造成的損傷。

“無酸無潰瘍”是目前對(duì)胃潰瘍發(fā)病機(jī)制的普遍認(rèn)識(shí)，認(rèn)為引發(fā)胃潰瘍的主要原因是胃酸分泌過多或胃黏膜屏障功能障礙，因此臨床上常把抑制胃酸分泌和增強(qiáng)胃黏膜保護(hù)能力作為主要治療策略［13-14］。胃蛋白酶是胃液中一種重要的消化酶，由胃黏膜腺主細(xì)胞分泌，通常是以無活性的酶原形式存在，可被胃酸激活而發(fā)揮消化作用。胃潰瘍發(fā)生時(shí)，胃酸分泌量增加，誘發(fā)胃蛋白酶自身消化，引起胃黏膜損傷，促進(jìn)潰瘍形成［15］。胃泌素是一種胃腸多肽激素，具有促進(jìn)胃酸和胃蛋白酶原分泌的作用，可以直接通過與壁細(xì)胞上胃泌素受體結(jié)合或通過刺激胃組織釋放組胺來促進(jìn)胃酸分泌，故與胃潰瘍的發(fā)生有密切聯(lián)系［16-17］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠胃液pH值、胃蛋白酶水平和血清胃泌素水平進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示胃潰瘍大鼠胃液pH值顯著降低，胃蛋白酶和血清胃泌素水平顯著升高；紅茶菌則通過調(diào)節(jié)胃酸分泌，升高胃液pH值，降低胃蛋白酶和胃泌素分泌水平來起到對(duì)阿司匹林致胃潰瘍的保護(hù)作用。

綜上所述，紅茶菌對(duì)阿司匹林致大鼠GU具有較好地保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)胃酸分泌，升高胃液pH值，降低胃蛋白酶和胃泌素水平等途徑來實(shí)現(xiàn)。以上研究為紅茶菌在GU治療方面的開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。