藏藥訶子質(zhì)量標(biāo)志物訶子酸的分離分析及標(biāo)準(zhǔn)化研究

宋志博, 陳 濤, 王岱杰, 鄒登朗, 王 碩, 李洪梅, 劉亞蓉, 楊鳳梅, 海 平, 李玉林

(1.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所, 青海 西寧 810001； 2.山東省分析測試中心, 山東 濟(jì)南 250014；3.青海省藥品檢驗檢測院 中藥(藏藥)質(zhì)量控制重點實驗室,青海省中藥(藏藥)現(xiàn)代化研究重點實驗室, 青海 西寧 810016；4.青海師范大學(xué), 青海 西寧 810008； 5.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

標(biāo)準(zhǔn)樣品是確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量必不可少的標(biāo)準(zhǔn)參照物，具有良好的穩(wěn)定性、量值準(zhǔn)確性和高度均勻性.利用標(biāo)準(zhǔn)樣品作為標(biāo)準(zhǔn)參照物對產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評價，可以保證測試結(jié)果具有可溯源性、準(zhǔn)確性與合法性.研制天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品，可以解決我國中醫(yī)藥、食品及化妝品等多行業(yè)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)樣品極度缺乏，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量控制和檢測的問題[1-3].

訶子是使君子科植物訶子TerminaliachebularRetz.及其變種絨毛訶子TerminaliachebularRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實[4]，別名訶黎勒、訶黎，藏醫(yī)、蒙醫(yī)稱“阿如拉”，原產(chǎn)于印度、緬甸，在我國云南、廣東、廣西、西藏等地均有分布[5].藏醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，訶子有全部藏藥具備的六味、八性、三化味和十七效，能治療很多種疾病，被廣泛用于治療哮喘、喉嚨痛、痢疾、血栓、痛風(fēng)和心臟病等[6-8].在部頒標(biāo)準(zhǔn)收錄的200個藏藥處方中，有118種含有訶子，由此訶子被稱為“藏藥之王”[9].訶子已被收錄于2020版中國藥典，但缺乏含量測定項[4]，不利于其開發(fā)利用.訶子主要含有鞣質(zhì)、酚類、苯丙素類、黃酮和三萜類等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤等作用[10-14].訶子酸是訶子中的特征性鞣質(zhì)類成分，具有抗氧化、抗炎、降糖、保肝、強(qiáng)心、抗菌等作用，與訶子的藥效類似[15-18]，可作為控制藥材質(zhì)量和成藥質(zhì)量的重要指標(biāo)，目前國內(nèi)外還沒有這種化合物的標(biāo)準(zhǔn)樣品.為了滿足藥材及新藥研發(fā)、質(zhì)量控制、分析檢測工作的需求，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、溯源性，急需研制訶子酸國家標(biāo)準(zhǔn)樣品.

本研究參照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則，以訶子的干燥成熟果實為原料，圍繞其中的特征性成分訶子酸，開展了制備工藝、純度分析、結(jié)構(gòu)確證、均勻性、穩(wěn)定性和定值等研究，成功研制了訶子酸(GSB 11-3725-2020)國家標(biāo)準(zhǔn)樣品.

1 試驗部分

1.1 儀器

CTXNW-100B循環(huán)超聲提取儀(北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司)；50 L大孔樹脂純化柱(浙江溫兄機(jī)械閥業(yè)有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)； Waters e2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；Agilent 6520 Q-TOF液相質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；SHIMADZU TG-40 DTA-40M 熱重分析儀(日本島津公司)；UV-2550紫外可見分光光度計(日本島津公司)； Vertex 70紅外光譜儀(德國布魯克公司)；LC-8A島津高效制備液相色譜儀(日本島津公司)；GLZ-1B冷凍干燥機(jī)(上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司)；R 1020旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)； BRUKER 400 MHz核磁共振波譜儀(德國布魯克公司).

1.2 試劑

高效液相色譜(HPLC)及HPLC-質(zhì)譜(MS)使用甲醇(山東禹王公司)、乙腈(武漢弗頓控股有限公司)為色譜純，乙醇為分析純(成都市科隆化學(xué)品有限公司)，水為超純水.訶子果實購自青海省西寧市藥材市場，由青海民族大學(xué)熱增才旦教授鑒定為使君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz.)的果實.

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取干燥訶子果實藥材10 kg，破碎機(jī)破碎，使用100 L 60%乙醇在室溫下超聲提取1次，提取1 h.將提取液濃縮至無醇味后冷凍干燥，得到訶子果實粗提取物.

取訶子果實粗提取物，分散于水中，緩慢倒入裝有D101大孔樹脂的層析柱中，先用30%乙醇洗脫至無色，再用50%乙醇洗脫，得到訶子酸洗脫組分，減壓濃縮后冷凍干燥得到富集組分.將富集組分注入到制備液相色譜中分離，得到訶子酸樣品.

采用HPLC進(jìn)行樣品分析，分析條件：Agilent 1260高效液相色譜儀；Agela Innoval C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱；流動相：甲醇-0.5%乙酸水溶液，0～30 min，45%-80%甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：274 nm.制備液相分離條件：LC-8A島津高效制備液相色譜儀；Reprosil 100 C18(250 mm×20 mm, 10 μm)制備色譜柱；檢測波長274 nm；流速：18 mL/min；流動相為甲醇-水，45%甲醇等度洗脫.

1.3.2 純度分析

(1) HPLC純度分析：Waters e2695高效液相色譜儀；Agela Innoval C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相：乙腈-0.5%乙酸水溶液(體積比為16∶84).流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時間：30 min；檢測波長：200～400 nm.

(2) 液相(LC)-MS純度分析：Agilent 6520 Q-TOF液相質(zhì)譜儀；色譜柱：Agela Innoval C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.5%乙酸水溶液(體積比為16∶84)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時間：30 min.

MS條件：ESI電噴霧離子源，毛細(xì)管電壓4.0 kV，載氣：普氮，載氣流速：10 L/min，載氣溫度：300 ℃，掃描范圍為m/z為100～1 000.

1.3.3 水分和灰分含量測定

依據(jù)GB 606-2003《化學(xué)試劑 水分測定通用方法 卡爾·費(fèi)休法》，測定水分含量.

根據(jù)文獻(xiàn)[19]，采用熱重分析儀測定標(biāo)準(zhǔn)樣品灰分，稱取10 mg樣品坩堝內(nèi)，以40 ℃/min的升溫速率從初溫25 ℃升至800 ℃，保持時間60 min.

1.3.4 結(jié)構(gòu)確證

通過紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)技術(shù)對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn).

1.3.5 均勻性檢驗

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品導(dǎo)則要求[20]，采用隨機(jī)順序重復(fù)測量的方法，隨機(jī)抽取10瓶分裝后的樣品，分別從每瓶中稱取0.5 mg樣品3份，分別使用1.0 mL甲醇溶解，樣品按“1.3.2”項下HPLC純度分析方法進(jìn)行分析，采用方差分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[21].第一次：1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第二次：10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第三次：2-4-6-8-10-1-3-5-7-9.

瓶間方差使用式(1)計算：

(1)

式中，MS：均方差，n：樣品組數(shù)

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差是該方差的平方根：

(2)

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差可由MSwithin計算：

(3)

均勻性檢驗的不確定度ubb=sbb.

1.3.6 穩(wěn)定性檢驗

(1)加速穩(wěn)定性檢驗：從分裝后的樣品中隨機(jī)抽取15瓶樣品，3瓶一組分別放置于-20、2～8、20、40、60 ℃保存.本研究以6天為期，按“1.3.2”項下HPLC純度分析方法對制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢驗，定值結(jié)果是測定2次的平均值.

(2)長期穩(wěn)定性檢驗：將樣品分裝后，于4 ℃冰箱中保存.本研究以兩年為期，按“1.3.2”項下HPLC純度分析方法，對制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品每6個月取一次樣進(jìn)行檢驗，定值結(jié)果是測定5次的平均值并使用t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析.

斜率可以使用式(4)計算：

(4)

截距由式(5)計算：

(5)

直線上點的標(biāo)準(zhǔn)偏差可由式(6)計算：

(6)

與斜率相關(guān)的不確定度使用式(7)計算：

(7)

自由度為n-2和p為0.95(95%置信水平)的分布t因子等于3.182.

1.3.7 定值

按照標(biāo)準(zhǔn)品導(dǎo)則要求，由8家實驗室(如表1所列)對訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行協(xié)作定值.隨機(jī)抽取24瓶樣品，每個定值實驗室送3瓶，每瓶平行測定2次.定值實驗室將樣品配成一定濃度的溶液，高效液相色譜儀測定，采用峰面積歸一化法進(jìn)行純度定值[22].

表1 參加定值的實驗室及儀器型號

測定總平均值：

(8)

實驗室內(nèi)重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(9)

實驗室間再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(10)

實驗室總平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(11)

實驗室總平均值的不確定度：

(12)

其中，N：測定總次數(shù)；p：定值實驗室個數(shù)；n：每個實驗室測量次數(shù).

1.3.8 不確定度評價

標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)展不確定度由4部分合成：分別是標(biāo)準(zhǔn)樣品定值分析引入的不確定度、均勻性引入的不確定度、短期穩(wěn)定性引入的不確定度和長期穩(wěn)定性引入的不確定度[23].

總平均值不確定度：

(13)

均勻性不確定度：

ubb=sbb= (MSamong-MSwithin)/n

(14)

穩(wěn)定性不確定度：

(15)

擴(kuò)展不確定度：

(16)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的制備與分離

樣品的HPLC分析色譜圖如圖1所示.

圖1 樣品HPLC分析色譜圖

在制備液相色譜條件的優(yōu)化時，流速與流動相對分離效果影響明顯.通過式(17)計算[24]，得到制備液相色譜最優(yōu)流速為18 mL/min.

Fp=Fa× (Dp/Da)2

(17)

式中，F(xiàn)p為制備液相色譜的流速，F(xiàn)a為制備液相色譜的流速，Dp和Da分別為制備柱與分析柱的直徑.

經(jīng)計算，HPLC分析時，訶子酸出峰時甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%左右.因此，本研究在進(jìn)樣量為100 mg/5 mL、檢測波長為274 nm的條件下，首先采用甲醇-0.5%乙酸水溶液(體積比為60∶40)為流動相等度洗脫，未實現(xiàn)較好的基線分離.逐步降低甲醇濃度改善分離效果，當(dāng)甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于45%時，可以實現(xiàn)較好的基線分離.但甲醇濃度越低，分離時間越長.為減少分離時間，本研究選用45%甲醇等度洗脫.分離色譜圖如圖2所示.

圖2 訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品制備的液相色譜分離圖

2.2 純度分析

2.2.1 HPLC純度分析

扣除溶劑色譜峰后，對樣品色譜峰進(jìn)行面積歸一法定量，經(jīng)積分，樣品純度在98%以上，三維色譜圖如圖3所示.

圖3 訶子酸標(biāo)準(zhǔn)品的三維色譜圖

2.2.2 LC-MS純度分析

正負(fù)離子模式下總離子流圖如圖4所示.從總離子流圖中未發(fā)現(xiàn)明顯雜質(zhì)峰存在.

圖4 訶子酸總離子流圖

2.3 水分和灰分含量測定

經(jīng)測定，訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品中水分含量為0.06%，灰分含量為0.07%.

2.4 結(jié)構(gòu)確證

UV λmax(EtOH)：274 nm；IR KBrνmax(cm-1)：3 351 (νO-H)，1 704 (νC=O)，1 609, 1 531, 1 447(νC= =C), 1 313, 1 165, 1 021 (νC-O-C)；正離子模式：實測值m/z為974.145 4 [M+NH4]+，計算值m/z為974.146 9 [M+NH4]+，推測分子式為C41H32O27；負(fù)離子模式：實測值m/z為955.105 4 [M-H]-，計算值m/z為955.105 8 [M-H]-，推測分子式為C41H32O27.

制備樣品的1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)如表2、3所列，與文獻(xiàn)[25] 比對，確定結(jié)構(gòu)為訶子酸.

表2 訶子酸的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)

表3 訶子酸的核磁共振碳譜數(shù)據(jù)

2.5 均勻性檢驗

以F檢驗，確定訶子酸樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，結(jié)果如表4、5所列.

由表4、5可見，以υ1(即組間)為9及υ2(即組內(nèi))為20，查F界值表，得訶子酸F0.05(9, 20)為2.39.由于：

表4 每瓶的平均值、方差和測量次數(shù)

F=MSamong/MSwithin=1.12

(18)

所以本樣品是均勻的.經(jīng)計算，均勻性不確定度為0.01%.

表5 均勻性研究的方差分析

2.6 穩(wěn)定性檢驗

2.6.1 加速穩(wěn)定性檢驗

訶子酸在5個不同溫度下放置6天后測得樣品平均純度為98.17%，不確定度為0.05%，符合要求.對標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液穩(wěn)定性進(jìn)行考察，選取乙腈和甲醇作為保存溶劑，在6天時間內(nèi)，兩種標(biāo)準(zhǔn)樣品在乙腈和甲醇保存中均具有較好的溶液穩(wěn)定性.

2.6.2 長期穩(wěn)定性檢驗

由表6數(shù)據(jù)可得，訶子酸每次測得的平均值在測定時間內(nèi)沒有隨時間的變化而明顯的升高或降低.

表6 長期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)

經(jīng)計算，斜率變化的絕對值：

︱b1︱

(19)

即︱b1︱低于0.031 82，所以，斜率的變化不顯著，因而訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品在二年內(nèi)穩(wěn)定性良好.有效期t為24個月的長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻(xiàn)為u=sb·t=0.24%.

2.7 定值分析

對測定結(jié)果，采用格拉布斯(Grubbs)檢驗法進(jìn)行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值，測定結(jié)果呈正態(tài)分布.從以上對檢驗數(shù)據(jù)的考察，所得數(shù)據(jù)符合GB/T 15000.3—2008統(tǒng)計計算要求.

根據(jù)GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成.扣除水分和灰分后，依據(jù)高效液相色譜法峰面積歸一法所得測定結(jié)果，訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)值為：

(1-0.06%-0.07%)×98.21%=98.08%

(20)

統(tǒng)計分析結(jié)果如表7所列.

表7 訶子酸定值結(jié)果統(tǒng)計分析表

2.8 擴(kuò)展不確定度的評定

經(jīng)計算，訶子酸置信度為95%的擴(kuò)展不確定度均為0.50%.

3 結(jié)論

本研究針對2020版藥典收錄的特色藏藥材缺乏含量測定項的現(xiàn)狀，圍繞其中的特征性成分訶子酸，并根據(jù)導(dǎo)則要求對訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性和定值研究，得到了定值結(jié)果為98.08%，置信度為95%的不確定度值0.50%的訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，符合國家一級標(biāo)準(zhǔn)樣品技術(shù)要求.建立了基于大孔樹脂和制備液相色譜技術(shù)的訶子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備工藝，可以為相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測、質(zhì)量控制等工作提供物質(zhì)基礎(chǔ).