兩例輸入性新冠肺炎患者核酸檢測結(jié)果分析*

于翔翔，楊煥森，毛 柯，于 其，高玉朋，朱曉露

連云港市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 連云港 222000

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是引起新冠肺炎（COVID-19）的病原體，在2020年1月首次被我國學(xué)者鑒定［1-2］，SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）β屬成員之一，RNA病毒，基因組全長30 kb左右，外有囊膜，狀如“王冠”，有典型冠狀病毒特征，核苷酸序列與一種蝙蝠來源的冠狀病毒的同源性達(dá)86.9%～89.0%［3］。2019年12月新冠疫情暴發(fā)，疫情迅速擴(kuò)散至世界各地，2020年3月11日，世衛(wèi)組織宣布新冠疫情已經(jīng)構(gòu)成全球性大流行［4］。近期境外輸入性病例增多［5］，本研究選取連云港地區(qū)兩例SARS-CoV-2核酸檢測陽性入境人員的結(jié)果進(jìn)行比較，分析患者排毒規(guī)律及病毒傳染性強(qiáng)弱問題，為以后新冠疫情的防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 病例來源

兩例新冠患者資料來自本中心2020年3月—5月收檢的病例，患者全部收治于連云港市傳染病定點(diǎn)醫(yī)院—第四人民醫(yī)院。本研究的病例采用咽拭子標(biāo)本中檢測出SARS-CoV-2核酸陽性作為臨床確診COVID-19的依據(jù)，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)參考《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［6］。兩例患者的相關(guān)臨床資料，見表1。

表1 兩例新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者臨床病例資料情況

1.2 資料收集

對兩病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析，中心流調(diào)專員對病例開展個(gè)案流行病學(xué)調(diào)查，收集資料的主要內(nèi)容包括患者一般情況、發(fā)病時(shí)間、流行病學(xué)史、癥狀等，資料真實(shí)準(zhǔn)確，具體方法參照《新型冠狀病毒感染的肺炎病例流行病學(xué)調(diào)查方案》［7］。

1.3 樣品采集

對兩例患者進(jìn)行咽拭子采集，送本中心進(jìn)行核酸檢測，具體步驟參照《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第四版）》［8］。

1.4 檢測方法

咽拭子的核酸提取使用碩士自動核酸提取儀，提取試劑使用儀器配套核酸提取試劑，試劑批號20200324。核酸提取完成后，用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行核酸檢測，熒光PCR儀型號appliedbiosystems QuantiStudio 7 Pro，核酸檢測試劑使用兩種：伯杰生物科技股份有限公司生產(chǎn)的2019新冠狀病毒ORF1ab/N基因核酸檢測試劑盒（雙重?zé)晒釶CR法，批號20200309A）（簡稱“伯杰”）、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法，批號2020019）（簡稱“達(dá)安”），具體步驟參照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行操作，見表2。

2 結(jié)果

2.1 確診COVID-19病例1在確診治療及隨訪過程中新型冠狀病毒檢測結(jié)果分析

本研究中病例1患者臨床癥狀為輕型，從第1次新型冠狀病毒核酸陽性確診到連續(xù)兩次核酸陰性出院，周期是17天。患者出院后第7天隨訪采集咽拭子檢測核酸，出現(xiàn)單通道陽性（ORF1ab陽性，Ct值37）情況，緊接著在隨后一天，也就是第8天采集咽拭子核酸檢測，結(jié)果陰性，按照方案要求，此病例未計(jì)入出院后復(fù)陽病例。出院第13天隨訪采樣檢測，結(jié)果仍為陰性，見表3。

表3 病例1在診療過程中新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測結(jié)果

2.2 新型冠狀病毒無癥狀感染者病例2的核酸檢測結(jié)果分析

病例2患者無臨床癥狀，在入境人員集中核酸篩查中檢測出新型冠狀病毒核酸陽性，屬于無癥狀感染者。從第1次核酸陽性確診到連續(xù)兩次核酸陰性出隔離點(diǎn)，周期為44天。連續(xù)多天采樣，患者咽拭子中病毒核酸檢測Ct值由低變高，說明咽拭子標(biāo)本中病毒載量由多變少，見表4。

表4 病例2在診療過程中新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果

3 討論

2019年12月出現(xiàn)流行的SARS-CoV-2是β屬冠狀病毒成員之一［9-10］，是引起新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的病原體。自2019年12月以來，新型冠狀病毒出現(xiàn)，并迅速擴(kuò)散到世界各地，引發(fā)大流行［4］。對新型冠狀病毒的研究雖有一定成績，但在病毒檢測、COVID-19患者治療及無癥狀感染者防控等方面仍需深入探索。近期，入境歸國人員增加，多地出現(xiàn)入境人員中SARS-CoV-2核酸檢測陽性情況，引起專家學(xué)者的注意。本研究選取了近期入境人員中兩例SARS-CoV-2核酸檢測陽性患者進(jìn)行分析，通過檢測結(jié)果分析患者體內(nèi)SARS-CoV-2變化趨勢，初步探討SARS-CoV-2感染患者后的不同情況及治療防控過程中可能遇到的問題。

兩例患者均是2020年3月入境人員，在集中核酸篩查過程中被檢測出新型冠狀病毒核酸陽性，病例1有輕微臨床癥狀，屬輕型患者；病例2無明顯臨床癥狀，被認(rèn)為是無癥狀感染者。兩人檢出核酸陽性后，分別被傳染病定點(diǎn)醫(yī)院收治入院。兩例患者首次新冠病毒核酸檢測陽性時(shí)間均為2020年3月25日，均無基礎(chǔ)疾病。從1次SARS-CoV-2核酸檢測陽性確診到轉(zhuǎn)陰（連續(xù)兩次核酸檢測陰性）周期分別是：16天、43天，這表示兩例患者體內(nèi)清除病毒時(shí)間不同。有相關(guān)研究表明［11］，新型冠狀病毒感染人體后，確診后的排毒時(shí)間最短為8天，中位排毒時(shí)間為20天，最長可達(dá)37天。本研究中病例1排毒時(shí)間為16天，病例2排毒時(shí)間更是長達(dá)43天，比報(bào)道中的最長排毒時(shí)間還要長6天。推測患者根據(jù)自身免疫情況清除病毒的時(shí)間不盡相同，患者癥狀輕重跟排毒時(shí)間無關(guān)，反而無癥狀的感染者排毒時(shí)間更長一些，不過這個(gè)結(jié)論需要更多數(shù)據(jù)支持。

對本研究中兩例患者核酸檢測結(jié)果Ct值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在確診初期，SARS-CoV-2核酸檢測Ct值偏低，病例1首診ORF1ab/N雙通道Ct值為30/30，病例2首診ORF1ab/N雙通道Ct值為28/18，這表明在病程初期，患者體內(nèi)病毒含量高。之后的連續(xù)監(jiān)測過程中兩病例的核酸檢測Ct值均逐步升高，至病程末期，核酸檢測變?yōu)殛幮?，這表明在COVID-19及無癥狀感染的整個(gè)過程中，采集的標(biāo)本中病毒核酸含量越來越低，患者體內(nèi)病毒載量逐漸減弱到可檢測水平，推測隨著病程進(jìn)展，患者的傳染水平也逐漸降低。

病例1在出院后第7天隨訪過程中出現(xiàn)SARS-CoV-2核酸檢測單通道陽性（ORF1ab/N，37/—），緊接著第8天隨訪過程中SARS-CoV-2核酸檢測雙通道陰性（ORF1ab/N，—/—），按照方案要求，核酸檢測單通道陽性者需重復(fù)檢測，兩次均為陽性者才可作為陽性確診依據(jù)，雖然病例1在出院隨訪過程中出現(xiàn)1次單通道陽性情況，但緊鄰的第2天采樣檢測為陰性，未列入出院后陽轉(zhuǎn)病例，但當(dāng)日核酸檢測結(jié)果熒光曲線起跳明顯，是典型“S”型曲線，分析原因可能是因?yàn)榛颊唧w內(nèi)依然攜帶病毒，只是處于低排毒水平，又或者是因?yàn)椴蓸尤藛T手法不同，采到的病毒含量在試劑檢出限水平徘徊。

病例2在首次核酸檢測陽性后被隔離治療觀察，之后的43天中咽拭子核酸檢測一直為陽性，本病例是目前疫情期間連云港地區(qū)所有核酸檢測陽性患者中排毒時(shí)間最長的病例，對本病例的研究有特殊意義。縱觀病例2的整個(gè)核酸檢測過程，Ct值從最初確診的雙通道陽性28/18，到中期4月9日（29/29）、4月12日（31/32）、4月16日（34/34），再到后期4月27日（35/36）、4月30日（35/36）、5月6日（37/36），Ct值逐步升高，直至變成陰性。Ct值變化反映標(biāo)本中病毒含量情況，也間接反映患者排毒情況。表4中Ct值的變化提示隨著患者感染病毒時(shí)間的延長，體內(nèi)病毒載量逐漸降低，推測相應(yīng)的傳染性也會降低，但對于病程后期患者的傳染性高低還需流行病學(xué)數(shù)據(jù)的支持，因此對康復(fù)期及無癥狀感染者的密切接觸人群的監(jiān)測非常重要。

本中心在疫情期間承擔(dān)全市部分初篩工作和全部陽性患者核酸復(fù)核工作，在檢測過程中遇到假陰性問題，筆者認(rèn)為在感染過程中，隨著患者自身免疫反應(yīng)及外界藥物治療，患者體內(nèi)病毒載量降低，疾病進(jìn)展過程中身體各部分排毒量不同，可能造成鼻拭子、咽拭子及肛拭子核酸檢測陰陽性結(jié)果不同。對檢測結(jié)果產(chǎn)生假陰性的可能進(jìn)行分析：（1）標(biāo)本采集不合格，在標(biāo)本采集過程中未能采集足夠量的人體細(xì)胞，致使病毒含量低于試劑盒檢出限；（2）試劑盒靈敏度問題，本研究中使用過兩種核酸檢測試劑盒，其中伯杰品牌中PCR循環(huán)數(shù)為40個(gè)循環(huán)，達(dá)安品牌中PCR循環(huán)數(shù)為45個(gè)循環(huán)，循環(huán)數(shù)越多相應(yīng)的收集熒光信號越強(qiáng)，靈敏度越高，但相應(yīng)的特異性會降低，在病例2的檢測中曾同時(shí)使用這兩種試劑檢測，在病程后期，出現(xiàn)兩種試劑盒核酸檢測結(jié)果不一致的情況，其中達(dá)安檢測陽性，伯杰檢測陰性，這提示檢測結(jié)果跟試劑盒的靈敏度有關(guān)；（3）與患者排毒情況有關(guān)，隨著病程進(jìn)展，患者排毒量越來越低，造成采集的標(biāo)本中病毒含量處于檢測限邊緣；（4）與反復(fù)凍融標(biāo)本有關(guān)，對于病毒含量低的標(biāo)本會出現(xiàn)第1次弱陽，凍融之后第二次檢測陰性的結(jié)果，這可能跟反復(fù)凍融破壞了標(biāo)本中的病毒核酸有關(guān)。

現(xiàn)有研究表明，病毒的傳播能力一般與其對宿主的致病性呈負(fù)相關(guān)，隨著傳播持續(xù)，病毒基因組會朝提高傳播能力并降低致病性的趨勢進(jìn)化［12］，大部分新出現(xiàn)的病毒一般具有致病性強(qiáng)和傳播能力弱，第一代病毒的首批感染者死亡率高的情況，但本次疫情新型冠狀病毒對人類有很好的適應(yīng)性，并能在人與人間高效傳播，推測基礎(chǔ)傳染數(shù)R0在2～3之間。本次新冠疫情一開始，我國就采取了強(qiáng)有力的防控措施，這在一定程度上減緩新冠病毒全球擴(kuò)散趨勢。本研究中病例2感染的新型冠狀病毒對患者無明顯致病性，但排毒天數(shù)長達(dá)43天，這符合病毒朝低致病性進(jìn)化的規(guī)律，至于是否具有高傳播能力還需進(jìn)一步監(jiān)測。本次新冠疫情中的新型冠狀病毒屬于RNA病毒，基因組具有較高的突變率，容易出現(xiàn)跨種族傳播情況，病毒一旦突破種族屏障，容易引起大流行。

本研究中兩例SARS-CoV-2核酸檢測陽性患者均是3月入境人員，病例1有輕微臨床癥狀，屬輕型患者；病例2無明顯臨床癥狀，被認(rèn)為是無癥狀感染者。通過對整個(gè)病程及出院隨訪核酸檢測，發(fā)現(xiàn)不同患者清除體內(nèi)新冠病毒的時(shí)間不盡相同，患者癥狀輕重跟排毒時(shí)間無關(guān)，反而無癥狀的感染者排毒時(shí)間更長一些，在COVID-19及無癥狀感染的整個(gè)過程中，采集的標(biāo)本中病毒核酸含量越來越低，患者體內(nèi)病毒載量逐漸減弱到可檢測水平，推測隨著病程進(jìn)展患者的傳染水平也逐漸降低，但對于病程后期患者的傳染性高低還需流行病學(xué)數(shù)據(jù)的支持，因此對康復(fù)期及無癥狀感染者的密切接觸人群的監(jiān)測非常重要。另外，本研究中病例2感染的新型冠狀病毒對患者無明顯致病性，但排毒天數(shù)長達(dá)43天，這符合病毒朝低致病性進(jìn)化的規(guī)律。