方 婷，徐 倩，金愛武，，鄧 瑩，駱爭榮，朱強(qiáng)根

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗室，浙江 杭州 311300；2.麗水學(xué)院 生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

毛竹Phyllostachys edulis為禾本科剛竹屬，單軸散生型常綠喬木狀竹類植物，地下由鞭根相連，屬于大型克隆植物，兼具筍、材兩用，是我國南方重要的森林資源之一，也是我國竹類資源中分布最廣的竹種[1]。以往對竹類植物的研究主要集中在生態(tài)功能、生理結(jié)構(gòu)形態(tài)、理化性質(zhì)和竹材的分類、生長繁殖以及生產(chǎn)加工利用等方面，并且已經(jīng)取得了一定的成果，同時竹類的遺傳改良研究也取得了一定進(jìn)展[2-4]。但是，竹類植物作為禾本科中木質(zhì)化程度高的喬木狀植物，其分子生物學(xué)研究嚴(yán)重滯后于同科的其他農(nóng)作物如水稻、小麥等。

植物組織中含有的酚類、糖類及其它次級代謝產(chǎn)物會造成提取出的RNA 降解、提取效率低或抑制后續(xù)操作的酶促反應(yīng)等[16]。目前雖已建立了許多較為成熟的分離RNA 的方法[17-18]，但由于不同植物或者同種植物不同部位組織中蛋白質(zhì)、多糖、酚類、脂類等成分含量的差異，不同部位組織的幼嫩程度不同，即使使用相同方法所得的結(jié)果也會大相徑庭[19]。毛竹不同組織中主要內(nèi)含物差異較大，例如毛竹葉片富含多糖物質(zhì)[20]，竹筍的主要成分為木質(zhì)素和纖維素[21]，種子中含有大量淀粉[22]。目前采用Trizol 法或者試劑盒方法提取毛竹葉片、花、筍等地上部分組織RNA 的技術(shù)已趨成熟，操作也相對簡易[8,23]，而針對毛竹地下部分生長、代謝異?；钴S的細(xì)根RNA 的提取方法以及毛竹種子RNA 的提取方法卻鮮有報道。因此，本研究以毛竹多個地上、地下組織及種子為材料，分別采用柱式Trizol法、Trizol 法、SDS 法、改良CTAB 法提取各組織的RNA，比較4 種方法提取的RNA 的質(zhì)量，篩選出不同組織最適的提取方法，為進(jìn)一步深入研究毛竹功能基因的作用機(jī)制、基因工程等奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料器皿

本試驗所用的毛竹細(xì)根（2年生）、冬筍于2019年10月—2020年1月采自麗水市遂昌縣，成熟葉、幼葉、枝采自麗水學(xué)院生態(tài)園林基地的毛竹2年生實(shí)生苗，氣霧根來自氣霧栽培的實(shí)生苗，種子購于四川眉山毛竹栽植基地。各個組織材料收集后立即放入液氮速凍，并保存于-70℃超低溫冰箱，備用。

RNA 提取中所用的溶液均用0.1%DEPC 處理過的水配制并高壓滅菌。研缽、玻璃器皿在使用之前180℃烘4～6 h，離心管、槍頭等塑料器材使用121℃高壓蒸汽滅菌40 min。RNA 電泳檢測均使用RNA 專用的電泳槽、梳子等，避免RNase的污染。

1.2 實(shí)驗方法

本研究采用了4 種RNA 提取方法，分別為柱式Trizol 法（上海生工公司）、Trizol 法、SDS 法、改良CTAB 法。

1.2.1 柱式Trizol 法

所用試劑盒為柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒（生工生物工程，上海），提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。1 mL Trizol 溶液中加入0.2 g 樣品粉末，充分混勻后，室溫放置5～10 min；加入0.2 mL 氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫放置3 min；4℃，12 000 r/min 離心10 min；吸取上清液到新的離心管中，加入1/2 體積無水乙醇，混勻；將吸附柱放入收集管中，用移液器將上述混勻溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，靜置2 min，12 000 r/min 離心3 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入500 μL RPE solution，靜置2 min，12 000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液，重復(fù)該步驟一次；將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min 離心2 min；之后吸附柱放入干凈的1.5 mL 離心管中，在吸附膜中央加入30 μL DEPC-treated 水，靜置5 min 后，12 000 r/min 離心2 min，所得到的RNA 溶液置于-70℃保存。

1.2.2 Trizol 法

1 g 樣品粉末中加入3 mL Trizol 裂解液（生工生物工程，上海），充分混勻，室溫放置5～10 min；加入0.6 mL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。4℃，12 000 r/min 離心10 min；取上清液到新的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min；4℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清液；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀。4℃，12 000 r/min 離心3 min 后，棄上清液。室溫干燥5～10 min；加入30 μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA，將所得到的RNA 溶液置于-70℃保存。

相對一般圖書，兒童繪本圖書價格偏高，如果不能對家長宣講繪本閱讀的重要性，有的家長會望而卻步，導(dǎo)致一部分家庭難以踏入兒童繪本館的門檻。目前，老約翰將關(guān)注點(diǎn)放在兒童閱讀、繪本閱讀上，卻忽略了與家長的有效溝通，而繪本閱讀自身的特性需要家長的理解和積極參與才能架起兒童閱讀繪本的橋梁。

1.2.3 SDS 法

參考Vineeta 等[24]用于提取毛竹節(jié)間RNA 的方法。樣品用液氮研磨，取1 g 樣品至4 mL 提取緩沖液和80 μL 巰基乙醇中，常溫孵育30 min，每5 min 渦旋一次；加入4 mL 混合液（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）后渦旋5 min；室溫11 000～12 000 g 離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的10 mL 離心管中；添加等體積的混合液（V苯酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶24∶1），渦旋5 min；室溫12 000 g 離心10 min 后，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的10 mL 離心管中，重復(fù)此步驟直到觀察到干凈的界面（大約2 次）；加入等體積的混合液（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）渦旋5 min；室溫12 000 g 離心10 min 后，轉(zhuǎn)移上清液到新的10 mL 離心管中，加入1/10 體積的3 mol NaOAc（pH 值5.2）和2.5 體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后4℃放置2～3 h；4℃，12 000 g 離心30 min，棄上清液，重新加入750 μL DEPC 水，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，加入250 μL 8 mol 的LiCl，4℃過夜；次日，4℃，12 000 g 離心30 min，棄上清液；加入1 mL 2 mol 的LiCl，4℃，17 000 g 離心10 min，棄上清液，重復(fù)一次該步驟；用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀后4℃12 000 g 離心5 min，棄上清液，再用1 mL 無水乙醇4℃ 12 000 g 離心5 min，棄上清液，室溫干燥5～10 min，最后加入30 μL DEPC 水溶解，所得到的RNA 溶液置于-70℃保存。

1.2.4 改良CTAB 法

在CTAB 方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，適用于提取富含多糖、多酚、色素以及單寧等次級代謝物的木本植物的改良CTAB 法，參照Chang 等[18]的方法，具體步驟如下：4 mL 的CTAB 提取液中加入80 μL 巰基乙醇，65℃水浴加熱；樣品用液氮研磨成粉末后，取1 g 加入到上述預(yù)熱的提取混合液中，渦旋混勻，65℃水浴10 min；冷卻后，加入4 mL 氯仿，渦旋混勻后室溫6 000 r/min 離心15 min；吸取上清液至新管中，再加入4 mL 氯仿，渦旋之后6 000 r/min 離心15 min；取上清液至新管中，加入600 μL LiCl（8 mol）4℃過夜；次日，4℃，6 000 r/min 離心30 min，倒掉液體后，加入65℃預(yù)熱的SSTE 溶液400 μL，反復(fù)吸打，將液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管里，加入等體積氯仿，混勻后10 000 r/min 離心10 min；取上清液并加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后在-70℃中放置30 min；之后在4℃下10 000 r/min 離心20 min；棄上清液，吸出殘余液體后室溫放置10 min，每管加30 μL DEPC 水溶解沉淀。

1.2.5 RNA 樣品質(zhì)量及純度檢測

取1 μL RNA 樣品，使用NanoDrop 2000 微量分光光度計檢測RNA 樣品的純度，分別記錄OD260/OD280以及OD260/OD230比值，如果OD260/OD280在1.8～2.0范圍內(nèi)，說明RNA 質(zhì)量良好，雜質(zhì)污染少。同時用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，通過28 S、18 S rRNA 條帶亮度判斷RNA 的完整性。1.2.6 DNA 的去除和cDNA 的合成

各方法提取的RNA 通過PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（Takara）去除基因組DNA 和反轉(zhuǎn)錄。去除DNA 的10 μL 反應(yīng)體系包括2 μL 的5×g DNA Eraser Buffer、1 μL的gDNA Eraser 以及1 μg 的RNA 樣品，用RNase free ddH2O 定容至10 μL?；旌戏磻?yīng)液置于42℃放置2 min 或者室溫5 min，得到的RNA 樣品用來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20 μL cDNA 合成反應(yīng)體系包括10 μL上述RNA溶液、1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×PrimeScript Buffer 2和4 μL RNase Free ddH2O，于37℃放置15 min，85℃反應(yīng)5 s，最后保存于4℃。

1.2.7 定量PCR 檢測

獲得的cDNA 經(jīng)過稀釋進(jìn)行內(nèi)參基因PhPP2A的檢測，使用TB GreenPremix Ex TaqtTMⅡ（Tli RnaseH Plus）進(jìn)行Real Time PCR 反應(yīng)。25 μL 反應(yīng)體系包括12.5 μL 2×TB GreenPremix Ex TaqⅡ（Tli RnaseH Plus）、1 μL 的PCR Forward Primer（10 μmol）、1 μL PCR Reverse Primer（10 μmol）、2 μL cDNA 作為模板和8.5 μL 滅菌水。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸30 s，讀板，循環(huán)40 次；95 ℃ 10 s，熔解曲線分析65 ℃到95 ℃，每5 s 升高1 ℃。其中內(nèi)參基因PhPP2A的選擇參考文獻(xiàn)[25]（FP：TGTTGGCGAGTCAGTTAGGTGTTG，RP：TCAAGTTGTTAGCGGCAGCATCTC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法對時間和試劑的消耗

運(yùn)用不同的方法對毛竹主要的組織進(jìn)行RNA提取，其中細(xì)根是指毛竹地下鞭節(jié)上的細(xì)根，是吸收營養(yǎng)的主要部分，氣霧根為氣霧栽培實(shí)生苗的根系，種子為去除種皮后的部分（圖1）。從操作難度、耗時、成本、RNA 質(zhì)量和產(chǎn)量5 個方面對4 種提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。由表1可知，每種方法各有優(yōu)勢，SDS 法所需試劑較為復(fù)雜繁多。試劑盒法耗時短且試劑準(zhǔn)備簡單，但與其他方法相比成本較高，尤其是當(dāng)樣品量大時所需要Trizol 試劑用量也相應(yīng)增加。

表1 4 種提取毛竹組織總RNA 方法的比較Table 1 Comparison of 4 methods for extracting RNA from moso bamboo

圖1 毛竹的不同組織Fig.1 Different tissues of moso bamboo

2.2 RNA 樣品的凝膠電泳分析

RNA 的凝膠電泳是判斷其質(zhì)量高低的一種重要方法，從18 S 和28 S rRNA 的完整性可以判斷RNA 有無降解及降解程度，同時還可以判斷有無DNA 污染。改良CTAB 法適用于提取毛竹各種組織的RNA，柱狀Trizol 法、Trizol 法和SDS法能從毛竹細(xì)根、葉片、枝以及筍等組織中提取出質(zhì)量相對較好的RNA，28 S rRNA 的亮度約是18 S rRNA 的2 倍，但對于種子、細(xì)根則提取效果不佳（圖2）。SDS 法提取成熟葉、種子的RNA 發(fā)生了不同程度的降解，條帶拖帶較為嚴(yán)重，其他組織18 S 和28 S rRNA 條帶較為清晰，部分樣品5 S rRNA 條帶不明顯。SDS 法包括一個額外的有機(jī)溶劑精制步驟，可去除內(nèi)源性酚類化合物和酸性酚（pH 值4.2），以穩(wěn)定提取緩沖液中的RNA。除此之外，還引入了2 次2 mol 氯化鋰的洗滌步驟，可以消除DNA 和多糖污染。因此，SDS 法提取的RNA 中的DNA 污染少，且A260/A280大多大于2，但SDS 法耗時較長，所需試劑較多，并易發(fā)生降解（圖2）。不同方法對于DNA 的去除程度不一樣，電泳圖顯示改良CTAB 法提取出來的RNA 中的DNA 污染較為明顯（圖2），而其余3 種方法可以較好地除去大部分的DNA，增加RNA 的純度。

圖2 各組織RNA 凝膠電泳Fig.2 RNA Gel electrophoresis of different tissues

2.3 RNA 濃度與純度分析

進(jìn)一步測定RNA 濃度，比較4 種方法提取的RNA 的質(zhì)量和純度。不同方法得到的RNA 濃度因材料而異，幼嫩的組織如幼葉、氣霧根、筍等濃度較高。Trizol法中的樣品受到5 S rRNA的影響，濃度偏大，尤其是在筍、氣霧根、成熟葉和幼葉中。SDS 方法中RNA 濃度雖然與其他3 種方法相比有顯著差異，但由于樣品發(fā)生降解，短片段增多導(dǎo)致濃度增大，其RNA 質(zhì)量不適合用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗。對于細(xì)根和種子樣品，改良CTAB法提取的RNA 濃度優(yōu)于其他方法，尤其是種子，與其他3 種方法相比均有顯著性差異（表2）。

表2 不同方法提取毛竹組織RNA 的濃度?Table 2 RNA concentrations by using different methods from tissue of moso bamboo

RNA 的純度可以通過A260/A280、A260/A230的比值判斷，一般情況下，A260/A280越接近2 則越純，低于1.8 可能存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)污染。柱式Trizol 法和Trizol 法提取細(xì)根和種子總RNA 的A260/A280低于1.8，其余均大于1.8，其中SDS 法和改良CTAB 法的A260/A280大多數(shù)在2～2.11 之間，表明RNA 純度較高，樣品中不含蛋白質(zhì)及苯酚的殘留或殘留少（圖3）。樣品中存在碳水化合物、鹽（胍鹽）、小分子物質(zhì)等污染物時，A230值會隨之增加，使用柱式Trizol 法和Trizol 法提取的RNA 中A260/A230均在2 以下，說明可能存在鹽（胍鹽）等殘留，其余兩種方法則大多在2 以上，進(jìn)一步說明RNA 純度較好（圖3）。

圖3 不同組織RNA 的質(zhì)量Fig.3 Quality of RNA in different tissues

綜合比較4 種總RNA 提取方法，柱式Trizol法和Trizol 試劑盒法所需樣品量少，提取總RNA的濃度相對較高，但不適用于對毛竹種子、細(xì)根的提??；SDS 法提取RNA 中DNA 污染少，但易降解且步驟繁瑣；改良CTAB 法適用于各組織，包括細(xì)根和種子，并且提取的總RNA 純度較好，但存在DNA 的污染。改良CTAB 法與其他3 種方法相比能更有效地提取RNA，且純度高，但DNA 雜質(zhì)較為明顯，表明DNA 處理不充分，后續(xù)通過對DNA 雜質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)處理后可以達(dá)到其他試驗的要求。

2.4 QRT-PCR 分析

樣品經(jīng)過去除DNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，將得到的cDNA 樣品分別進(jìn)行2 倍、5 倍、10 倍稀釋，以PhPP2A為內(nèi)參基因進(jìn)行定量PCR，再以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、以測得的Cq值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從稀釋曲線上計算擴(kuò)增效率，其計算公式見文獻(xiàn)[26]，經(jīng)計算，擴(kuò)增效率約為102%，表明cDNA 樣品質(zhì)量較好（圖4a）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，每種方法所用組織樣品順序依次是細(xì)根、氣霧根、成熟葉、幼葉、枝、種子、筍，除了發(fā)生降解的樣品和部分種子樣品外，其他樣品的cDNA 均能擴(kuò)增出內(nèi)參基因PhPP2A片段，條帶單一清晰，長度約150 bp（圖4）。

圖4 內(nèi)參基因的凝膠成像Fig.4 Gelation of internal reference genes

反轉(zhuǎn)錄效率受到不同樣品中雜質(zhì)的影響，內(nèi)參基因的本底表達(dá)量也有所差異。氣霧根、成熟葉、幼葉、枝、筍等樣品的反轉(zhuǎn)效率較高，大多數(shù)的Cq值在21～22 之間。相比改良CTAB 法，其他3 種方法提取的細(xì)根樣品由于A260/A280比值均低于1.8，可能有蛋白等雜質(zhì)的影響，并且本身的濃度低，反轉(zhuǎn)錄效率較低，Cq值在25～28 之間，采用改良CTAB 法提取的細(xì)根RNA 在反轉(zhuǎn)錄相同量后，它的Cq值達(dá)到了23.07（表3）。毛竹種子淀粉含量多，RNA 提取難度較大，4 種方法中僅有改良CTAB 法適合提取，但純度不高，雜質(zhì)的影響使反轉(zhuǎn)錄后的Cq值為28.32，可用于一些常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗。

表3 不同提取方法各組織cDNA 內(nèi)參基因的Cq 值?Table 3 Cq value of internal reference gene in different methods and tissues

3 結(jié)論與討論

不同RNA 提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在物種或組織上的可適用性存在差異，選擇合適的方法是獲得高質(zhì)量RNA 的前提[27-29]。目前已經(jīng)總結(jié)出了很多科學(xué)高效的RNA 提取方法，基本原理是將植物組織細(xì)胞破碎以后，把RNA 與蛋白質(zhì)、糖類以及DNA 等雜質(zhì)分離出來，在實(shí)際操作中，可以根據(jù)實(shí)際情況，包括時間成本、所需試劑量以及不同組織的特點(diǎn)等進(jìn)行選擇。

Trizol 法是最常用的RNA 提取方法之一，柱式Trizol 法是在Trizol 的基礎(chǔ)上加入了吸附柱，利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來，把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，最終把吸附在特異載體上的核酸洗脫下來，分離得到純化的核酸，使提取過程更加簡單易操作，這兩種方法耗時短，但可能會有胍鹽殘留，使A260/A230下降。同時這兩種方法有一定的局限性，不適用于一些多酚、糖類物質(zhì)比較高的組織，例如檀香心材、野生香蕉葉片等[30-31]，對毛竹木質(zhì)化程度較高的細(xì)根以及富含淀粉的種子等組織的提取效果也不好。本研究中兩種試劑盒法所提取的總RNA 產(chǎn)率低于另外兩種方法，與在菠蘿蜜中的研究結(jié)果一致[32]。SDS 法和改良CTAB 法適用于一些難提取的植物或組織，如木本植物的組織等[33]。本研究中的SDS 法參考毛竹節(jié)間RNA 提取方法，提取的RNA 濃度較高，但步驟繁瑣，耗時長，增加了RNase 污染機(jī)會，易發(fā)生RNA 降解。改良CTAB 法步驟較為簡單，對毛竹不同組織材料RNA 的提取均有不錯的效果，包括了細(xì)根和種子。從毛竹各組織的提取結(jié)果來看，改良CTAB法對各組織具有很好的適用性。

目前，關(guān)于毛竹的研究主要集中在葉片、花、筍等組織中，而一些木質(zhì)化程度較高的枝、根及淀粉含量高、堅硬的種子等還較少涉及，RNA 提取難度大可能是限制相關(guān)研究開展的一個重要因素。本研究中的4 種方法能夠提取出細(xì)根的RNA，但產(chǎn)率低，其中改良CTAB 法提取的RNA 反轉(zhuǎn)效率最高，Trizol 法次之。對于種子，改良CTAB 法提出的RNA 質(zhì)量最好，但反轉(zhuǎn)錄效率不高，可用于一般的分子生物學(xué)實(shí)驗。本研究可以為后續(xù)開展針對根系、葉片、種子等方面的研究提供一定的技術(shù)支持，但局限在于僅涉及到了較為常用的4種提取方法，對于試劑盒法不同公司產(chǎn)品的提取效率也會有所差異，因此在下一步研究中，可以通過多次優(yōu)化、合理組合等方式，進(jìn)一步地探索出提取毛竹各組織RNA 的最適方案，為加快竹類植物分子生物學(xué)研究提供理論參考。