李從虎，龍槿彥，吳 彥，胡佳慧，李國英，李文娟

(1.四川大學 皮革化學與工程教育部重點實驗室，成都 610065；2.安慶師范大學 生命科學學院，安徽 安慶 246133)

0 引 言

膠原是一種天然大分子產(chǎn)物，廣泛存在于動物的皮膚、軟骨等結(jié)締組織中，因具有良好的生物相容性、細胞吸附性和低免疫原性等優(yōu)良特性而廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥和組織工程等領(lǐng)域[1]。受到剪切力的作用，將膠原溶液制備成凝膠、海綿、膜、纖維等產(chǎn)品時，其粘彈性、抗變性能等理化特性會發(fā)生改變，最終影響到膠原產(chǎn)品的性質(zhì)和外觀[2]。由于流變學可以準確地反映蛋白質(zhì)等天然大分子在生產(chǎn)和加工過程中受外力作用而發(fā)生的形變，因此，對膠原溶液的流變性能進行系統(tǒng)的研究，揭示其內(nèi)部結(jié)構(gòu)與力學響應(yīng)之間的規(guī)律，對獲得穩(wěn)定的膠原產(chǎn)品具有十分重要的意義。

近年來，對膠原及其衍生物的流變行為的研究已有一定的報道。Ding等將羧甲基纖維素鈉引入到膠原溶液(8 mg/mL)中，其流動性能顯著提升[3]。Yang等人發(fā)現(xiàn)冪律方程、Carreau模型可有效擬合膠原溶液的穩(wěn)態(tài)流動曲線[4]。Chen等考察了己二酸-NHS酯(NHS-AA)對堿溶膠原溶液的流變性能，結(jié)果表明隨著NHS-AA濃度的升高到1.5 mmol/L時，溶液的彈性模量、粘性模量和復數(shù)粘度不斷增大；隨后，隨著NHS-AA濃度的繼續(xù)升高，溶液彈性模量、粘性模量和復數(shù)粘度反而下降[5]。作為一種蛋白質(zhì)，膠原溶液的流動性能對溫度十分敏感。段煉等研究了溫度對膠原溶液的穩(wěn)態(tài)流變性能的影響，發(fā)現(xiàn)膠原溶液具有明顯的假塑性，溫度升高剪切粘度卻下降[6]。

然而天然膠原難以在中性條件下溶解，且表面活性較低，限制了其應(yīng)用。若天然膠原能夠自身形成膠束等表面活性劑締合體系，則可將親脂藥物包裹在聚集體內(nèi)，不僅對藥物起到增溶、保護和穩(wěn)定作用，還對控制藥物的緩釋具有重要的意義。因此，作者在膠原的側(cè)鏈引入了疏水的月桂酰殘基和親水的琥珀酰殘基，制備得到一種具有兩親結(jié)構(gòu)的酰化膠原，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示[7]。?；z原不僅保持了天然膠原的生物活性，還提升了表面性質(zhì)[8-9]。在?；z原溶液的存儲、生產(chǎn)和應(yīng)用時，其流動性能必然會受到溫度的影響。因此，本文主要研究了?；z原溶液的穩(wěn)態(tài)剪切粘度、動態(tài)頻率掃描、蠕變以及觸變行為，并對其流動曲線進行了數(shù)學模擬，以期為該產(chǎn)品的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

圖1 ?；z原示意圖[7]Fig 1 Structural scheme of acylated collagen[7]

1 實 驗

1.1 實驗儀器

流變儀：MarsⅢ型，德國Haake公司。

1.2 ?；z原水溶液的制備

按照文獻[7]制備酰化膠原，將酰化膠原海綿溶解于0.01 mol/L的PBS(pH7.4)中，制備得到7.5 mg/mL的酰化膠原溶液，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 穩(wěn)態(tài)流變測試

采用流變儀和錐板模式(外錐角為1°，直徑為35 mm，板間距為0.053 mm)，選用粘度法模式，在控制速率的條件下測試?；z原溶液的穩(wěn)態(tài)流變性能，其中溫度范圍分別為25、27.5和30 ℃，剪切速率γ范圍為0.01～100 s-1。

1.4 動態(tài)流變測試

采用流變儀和錐板模式(外錐角為1°，直徑為35 mm，板間距為0.053 mm)，并在動態(tài)測試中選擇應(yīng)力控制模式下，研究?；z原溶液的粘彈性行為，測定彈性模量(G′)、粘性模量(G″)、復數(shù)粘度(η*)和內(nèi)耗(tanδ)隨著頻率的變化。測試溫度分別為25、27.5和30 ℃，應(yīng)變?yōu)?%，動態(tài)頻率0.01～10 Hz。

1.5 蠕變測試

將制備的酰化膠原溶液置于流變儀的錐-板夾具中(外錐角為1°，直徑為35 mm，板間距為0.053 mm)。分別在25、27.5和30 ℃下，對其施加1 Pa的應(yīng)力并持續(xù)100 s，記錄其蠕變狀況。隨后，在接下來的400 s里去除樣品上施加的應(yīng)力，使其慢慢回復，記錄其回復狀況。

1.6 觸變測試

分別在25、27.5和30 ℃條件下，將制備的?；z原溶液置于流變儀的錐-板夾具中(外錐角為1°，直徑為35 mm，板間距為0.053 mm)。設(shè)置剪切速率在150 s內(nèi)從0.01 s-1增大到50 s-1，然后剪切速率在接下來的150 s內(nèi)從50 s-1降低到0.01 s-1。

1.7 數(shù)學模擬

采用冪率方程、Carreau和Cross方程對不同溫度的?；z原溶液的穩(wěn)態(tài)剪切曲線進行擬合[10-11]；采用Leonov模型對酰化膠原溶液的動態(tài)頻率曲線進行擬合[12]；采用Burger模型對蠕變曲線進行擬合[13]；采用Herschel-Bulkley方程對觸變測試曲線進行擬合[14]。

其中，

冪率方程：

η=Kγn-1

(1)

式(1)為冪率方程的關(guān)系式，其中η是剪切粘度(Pa·s)，γ是剪切速率(s-1)，K是粘度指數(shù)，n為材料的非牛頓指數(shù)。

Carreau方程：

(η-η∞)/(η0-η∞)=[1+(λγ)2](q-1)/2

(2)

式(2)中，η是剪切粘度(Pa·s)，η0為零剪切粘度(Pa·s)，η∞為無窮剪切粘度(Pa·s)，γ是剪切速率(s-1)，n為材料的非牛頓指數(shù)，λ為體系常數(shù)。

Cross方程：

(3)

式(3)中，η是剪切粘度(Pa·s)，η0為零剪切粘度(Pa·s)，η∞為無窮剪切粘度(Pa·s)，α為特征弛豫時間(s)，m為材料常數(shù)。

Leonov方程：

(4)

(5)

式(4)和(5)中，Ωk=ωθk,θk代表在第k次松弛模型的松弛時間，ω和m0分別代表頻率和材料常數(shù)。

Burger方程：

γ(t)=σ0t/η0+σ0/G0+σ(1-e-t/λ/G1)

(6)

式(6)中，G0和G1都表示彈性系數(shù)，但G0反映酰化膠原溶液在應(yīng)力作用下抗形變的能力，而G1主要是阻止粘性原件的變形；σ0和η0分別代表應(yīng)力和產(chǎn)生不可回復殘留變形的粘性系數(shù)；λ是回復的延遲時間。

Herschel-Bulkley方程：

τ=τ0+βγa

(7)

式(7)中，τ0是屈服應(yīng)力，β和a分別是材料參數(shù)和冪指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)態(tài)流變測試

圖2揭示了?；z原溶液在25、27.5和30 ℃條件下的穩(wěn)態(tài)剪切曲線。由圖可知，隨著溫度的升高，酰化膠原溶液的剪切粘度呈現(xiàn)降低的趨勢。這是因為隨著溫度的升高，?；z原分子的無規(guī)則熱運動增大，其聚集體逐漸松散，使得粘度逐漸下降[6]。從圖中還可以看出，在測試溫度范圍內(nèi)，?；z原溶液的粘度都隨剪切速率的增加而減小，表現(xiàn)為剪切變稀行為[15]。這是因為剪切力增大，酰化膠原分子之間的相互作用力減弱，使得溶液的流動性逐漸增加[4]。

圖2 ?；z原溶液剪切粘度和剪切速率的關(guān)系Fig 2 Relationship between the viscosity (η)and the shear rate of acylated collagen solutions

表1所示為采用冪律方程擬合酰化膠原溶液的穩(wěn)態(tài)流變測試曲線參數(shù)。由表可知，擬合的相關(guān)系數(shù)R2均接近于1.0，表明該模型擬合效果較好。不同溫度條件下，n值小于1，表明?；z原溶液具有假塑性。隨著溫度的升高，n值不斷上升但K值逐漸下降，表明酰化膠原溶液的假塑性和粘度隨溫度的升高而不斷降低。擬合結(jié)果與實際測試結(jié)果相似，這是因為溫度升高，分子運動加快，分子之間的摩擦力和聚集體的纏結(jié)力不斷降低，導致?；z原的假塑性和粘度出現(xiàn)降低的趨勢。

表1 酰化膠原溶液在不同溫度下冪率方程擬合得到的參數(shù)Table 1 Parameters from Power law model fitting ofacylated collagen solutions at different temperatures

表2和3所示為?；z原溶液在不同溫度下Carreau和Cross方程擬合得到的參數(shù)。由表可知，用Carreau和Cross方程擬合得到的相關(guān)系數(shù)R2都接近于1，表明Carreau和Cross方程都能夠準確的描述?；z原溶液的剪切流動。Carreau與Cross方程中預測的零剪切粘度都是隨著溫度的上升而減小，說明溫度升高酰化膠原溶液的假塑性越弱，與穩(wěn)態(tài)剪切的實驗結(jié)果相符合。然而無窮剪切粘度非常小，這是因為當剪切速率非常高時，?；z原聚集體已經(jīng)解聚成單分子，溶液的流動已經(jīng)非常不穩(wěn)定，甚至被破壞，導致無窮剪切粘度非常小[16]。

表2 ?；z原溶液在不同溫度下Carreau方程擬合得到的參數(shù)Table 2 Parameters from Carreau model fitting of acylated collagen solutions at different temperatures

表3 ?；z原溶液在不同溫度下Cross方程擬合得到的參數(shù)Table 3 Parameters from Cross model fitting ofacylated collagen solutions at different temperatures

2.2 動態(tài)流變測試

在動態(tài)頻率測試中，彈性模量(G′)和粘性模量(G″)可以提供材料在液—固間響應(yīng)的結(jié)構(gòu)特性的重要信息[10]。圖3所示為?；z原溶液在不同溫度條件下的動態(tài)模量曲線。在所測試的溫度下，?；z原溶液均具有末端區(qū)和高彈區(qū)。G′和G″隨著溫度的升高而降低，但隨著頻率的上升而呈逐漸增大。在低頻下(G′G″)，酰化膠原溶液以彈性行為為主。隨著溫度的上升，交叉點(G′=G″)頻率也逐漸從0.037 Hz升高到0.160 Hz，表明在?；z原分子的松弛速率隨溫度的升高而加快，即松弛時間隨溫度升高而縮短。當溫度升高時，相鄰分子鏈CO和NH之間的氫鍵被破壞[17]，酰化膠原分子的熱運動能量增加，體系中分子之間的自由體積增大，使鏈段躍遷速度加快，并且形成的聚集體減小。

圖3 不同溫度下?；z原溶液的動態(tài)模量曲線Fig 3 Dynamic modulus of acylated collagen solutions at different temperatures

圖4所示為不同溫度下?；z原溶液的復數(shù)粘度和損耗因子曲線。由圖可知，?；z原溶液的復數(shù)粘度隨溫度的升高而降低，隨頻率的增加而降低。這一趨勢與穩(wěn)態(tài)剪切測試中酰化膠原溶液發(fā)生的剪切變稀是一致的。溫度的升高使分子之間的變換加快并減少分子之間的吸引力。然而在溶液體系中，分子之間的吸引力比分子之間的變換要強得多，因此粘度會隨溫度的升高而降低[18]。損耗因子(tanδ)是指G″與G′的比值(tanδ=G″/G′)。因此，當tanδ>1時，高分子溶液中的G″大于G′，所以該體系為粘性特征占優(yōu)勢；當tanδ<1時，高分子溶液中的G″小于G′，所以該體系為彈性特征占優(yōu)勢[19]。?；z原溶液的tanδ隨著溫度的升高而上升，表明?；z原溶液的粘性特征隨著溫度的升高而越來越強，這是因為溫度上升，?；z原溶液的流動性更強。

圖4 不同溫度下酰化膠原溶液復數(shù)粘度(a)和損耗因子(b)Fig 4 Complex viscosity and loss factor of acylated collagen solution under different temperatures

表4為?；z原溶液在不同溫度條件下采用Lenovo方程進行動態(tài)頻率測試擬合得到的參數(shù)?？梢姡琇enovo模型對?；z原溶液的動態(tài)頻率曲線具有較好的擬合效果(R2≈1.0)。隨著溫度的升高，ηk值不斷降低，表明酰化膠原溶液的粘度隨溫度升高而呈降低趨勢。擬合結(jié)果與實驗結(jié)果相符，這是因為溫度的升高，使分子間的相互作用力減弱，分子運動能力增強，導致酰化膠原溶液的流動性升高。

表4 酰化膠原溶液在不同溫度下Leonov方程擬合得到的參數(shù)Table 4 Parameters from theLeonov model fitting of the acylated collagen solutions at different temperatures

2.3 蠕變測試

圖5是對?；z原溶液在不同溫度條件下施加1 Pa的應(yīng)力所測得的蠕變曲線。從圖中可以看出，?；z原溶液在所測試的溫度范圍內(nèi)都表現(xiàn)出典型的蠕變行為，都具有可回復應(yīng)變和不可回復應(yīng)變。因此，在所測試溫度范圍內(nèi)，?；z原溶液依然具有普彈形變、高彈形變和粘性流動響應(yīng)，并表現(xiàn)出明顯的粘彈性。通常，柔量越大表明材料抵抗變形的能力越弱[20]。對?；z原溶液施加1 Pa的應(yīng)力持續(xù)100 s后，柔量隨溫度的升高而逐漸降低，表明?；z原溶液在低溫下具有較強的抵抗變形的能力。這是因為隨著溫度的升高，?；z原分子的熱運動增加，聚集體減小，使其更容易發(fā)生形變，最終導致其抵抗形變的能力變?nèi)?。當外力去除后，隨著溫度的升高，?；z原溶液均出現(xiàn)回復現(xiàn)象，其回復部分占最大柔量的比值從31%降低到26%，表明?；z原溶液發(fā)生形變后所能回復的應(yīng)變越小，在應(yīng)力作用下發(fā)生粘性流動所占的比例也越大。

圖5 不同溫度下酰化膠原溶液的蠕變測試曲線Fig 5 Creep curves of acylated collagen solutions at different temperatures

圖6為?；z原溶液在不同溫度條件通過Burger模型對蠕變階段的擬合示意圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Burger模型可以有效描述?；z原溶液抵抗變形的能力。通過模型可以預測，隨著溫度的升高，由于分子間的相互作用力減弱，導致?；z原溶液的彈性響應(yīng)和抵抗變形的能力逐漸降低。

圖6 Burger模型對?；z原溶液在不同溫度條件下蠕變曲線的擬合Fig 6 Creep curves of acylated collagen solutions simulated by the Burger model at different temperatures

2.4 觸變測試

圖7是?；z原溶液在不同溫度條件下的觸變環(huán)曲線。由圖可見，觸變環(huán)面積未見明顯改變，可能是因為所測試溫度范圍較小。然而，在50 s-1的剪切速率下，其剪應(yīng)力由52 Pa降低到41 Pa，表明?；z原溶液的粘度隨溫度升高而降低。隨著剪切速率的增加，酰化膠原分子纏結(jié)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞。當剪切速率逐漸降低時，酰化膠原分子結(jié)構(gòu)逐漸回復。由于這種回復程度小于分子結(jié)構(gòu)的破壞速率，導致酰化膠原觸變曲線的上行線和下行線不重疊[21]。

圖7 酰化膠原溶液在不同溫度下的觸變環(huán)曲線Fig 7 Thixotropic loop of acylated collagen solutions at different temperatures

圖8是使用Herschel-Bulkley方程對?；z原溶液在25 ℃條件下觸變測試的上行線和下行線分別進行的擬合示意圖。可以看出，Herschel-Bulkley方程的擬合曲線與實驗數(shù)據(jù)曲線可以較好的重合，且擬合的相關(guān)系數(shù)R2均接近于1.0。

圖8 Herschel-Bulkley方程對酰化膠原溶液觸變環(huán)曲線的上行線(a)和下行線(b)的擬合(25 ℃)Fig 8 Up curve and down curve of CBS solution (7.5 mg/mL)and simulated curves from Herschel-Bulkley model (25 ℃)

3 結(jié) 論

以一種新型的?；z原為研究對象，采用流變學方法研究其溶液的流變行為，得到以下結(jié)論：

(1)酰化膠原溶液屬于假塑性流體，隨著剪切速率的增大，表現(xiàn)出明顯的剪切變稀行為。

(2)隨著溫度的升高，酰化膠原溶液的粘度、觸變性和抵抗變形的能力降低。

(3)冪律方程、Carreau方程、Cross方程、Leonov方程、Burger模型和Herschel-Bulkley方程可以有效擬合?；z原溶液的流變曲線。