衛(wèi)國紅，王 利，萬學思，譚泳謠

中山大學附屬第一醫(yī)院1內分泌科，2保健科，廣東 廣州 510080；3中山大學中山醫(yī)學院，廣東 廣州510080

胰腺神經(jīng)內分泌腫瘤（PNENs）是胰腺上皮樣腫瘤中第2常見的腫瘤，其病死率高達60%［1,2］。盡管如此，因其發(fā)病率較低，臨床癥狀和體征常不典型，一直在臨床上被忽視而對其研究不足，導致近30 年來我國PNENs病例數(shù)量呈顯著上升，但患者生存期卻無明顯改善［3,4］。胰島素瘤是功能性PNENs中最為常見的一種，胰島素瘤的典型臨床表現(xiàn)為Whipple三聯(lián)征，但該病實際臨床表現(xiàn)復雜多樣，由于其引起的低血糖癥狀及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀往往與其他疾病類似，加之超聲、CT的確診率不高，均需由多科室會診，臨床上無法依據(jù)胰島素瘤細胞的形態(tài)學來判斷其良惡性質，目前亦無可靠臨床指標及分子標記物以用于區(qū)分良、惡性胰島素瘤［4］，極易漏診及誤診［5,6］。特別重要的是，正因為PNENs病程進展非常緩慢，確診時大多已有遠處轉移，而轉移性PNENs的5年生存率低至27%［7,8］，這給胰島素瘤的臨床治療提出了非常大的挑戰(zhàn)。同時，胰島素瘤中常見癌基因（myc,ras等）與抑癌基因（p53,Rb,p16等）表達均無明顯異常變化［5,6,9］，因此針對胰島素瘤為主的PNENs新的診斷生物標志物亟待闡明。

ELF4屬于ETS轉錄因子家族，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫中至關重要的癌基因［10］。ELF4是腫瘤惡性轉化不可或缺的因子，研究發(fā)現(xiàn)在Elf4（-/-）p53（-/-）的胚胎成纖維細胞（MEF）中，甚至癌基因H-Ras(V12)或者c-myc均不能使得MEF細胞惡性轉化［10］。ELF4與神經(jīng)膠質母細胞瘤、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，發(fā)揮著如抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞過度增殖及促進腫瘤血管新生等生物學功能［11,14］。本研究擬探究胰島素瘤中ELF4表達是否與其腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關性。

胰島素瘤等PNEN疾病臨床上少見，導致病例及組織標本的稀缺成為限制其發(fā)病機制研究的瓶頸，目前尚無理想模擬其發(fā)生發(fā)展的動物模型［2,9］。因此，國內外關于胰島素瘤發(fā)生、發(fā)展及演進研究尚未明確，目前的研究表明胰島細胞增殖失控是導致胰島素瘤發(fā)生的主要機制之一，而細胞過度增殖及抗凋亡的分子機制一直尚未明確。胰島素瘤細胞增殖和抗凋亡過程中的關鍵因子有待進一步闡明。

本研究以ELF4外源穩(wěn)定高表達的胰島素瘤BON細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)ELF4高表達可以促進人胰島素瘤細胞增殖，同時增強人胰島素瘤細胞抗凋亡能力，并闡明其機制是通過激活Akt通路而促進胰島素瘤細胞增殖和抗凋亡。本研究為闡明ELF4在胰島素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機理提供新的線索，并為胰島素瘤的診斷預后標志或治療提供可能的新靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞系及實驗試劑

人胰島素瘤細胞系BON（中國醫(yī)學科學院細胞庫），凍存于本實驗室液氮罐。胎牛血清FBS、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS均（Gibco）；表阿霉素（EPI）（Selleck）；抗ELF4抗體（Invitrogen），抗caspase-8前體抗體、抗caspase-8切割成熟體抗體、抗caspase-9前體抗體、抗caspase-9切割成熟體抗體、抗PARP前體抗體、抗PARP成熟體抗體、抗磷酸化Akt抗體（Thr308位點）、抗磷酸化Akt抗體（Ser473位點）、抗總Akt體、抗Actin抗體均（Cell Signaling Technology）。MTT（Genview）；DMSO（Sigma）。

1.2 外源穩(wěn)定高表達ELF4蛋白的細胞系的構建

通過逆轉錄病毒表達載體（pMSCV），構建質粒pMSCV-puro-ELF4-Flag，與包裝質粒pIK用磷酸鈣法共轉HEK-293T細胞，制備病毒液，然后感染人胰島素瘤細胞系BON。在培養(yǎng)基中添加嘌呤霉素作為細胞篩選標志物，并連續(xù)傳代細胞，以篩選建立穩(wěn)定高表達ELF4的細胞株（實驗組BON-ELF4）。構建載體對照組細胞BON-Vector。

收集和抽提第5代細胞的總蛋白，采用免疫印跡技術檢測證明穩(wěn)定高表達ELF4的細胞BON-ELF4是否構建成功。

1.3 免疫印跡實驗

收集各實驗組及對照組細胞，使用細胞裂解液，充分裂解消化細胞獲得總蛋白裂解液樣品，采用BCA法進行各組蛋白定量后，進行SDS-PAGE電泳；等待電泳完成后，準備6張Whatman 3M專用濾紙和1張PVDF膜，甲醇浸泡PVDF膜5 min，將夾子、海綿和專用濾紙浸泡于轉膜緩沖液中；取出SDS-PAGE凝膠，徹底去除濃縮膠部分，并把濾紙和PVDF膜裁成凝膠大?。话措娹D印裝置操作，負極-海綿-3 張濾紙-濃縮凝膠-PVDF膜-3張濾紙-海綿-正極板，將其放入轉膜槽中，加入轉膜緩沖液中；冰浴，按照300 mA 電流設置轉膜2 h；取出PVDF膜，使用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液封閉1 h；然后，采用待測蛋白的一抗抗體4 ℃過夜孵育，TBST洗膜，15 min/次，重復3次；采用相應的二抗抗體孵育1 h；TBST洗膜，15 min/次，重復3次；在暗房采用X片發(fā)光顯影定影而獲得數(shù)據(jù)圖。數(shù)據(jù)圖中條帶，經(jīng)掃描后使用Quantity One v4.6.2軟件測算出總體灰度值，并計算出相對灰度值：目的條帶的總體灰度值/相對應的內參條帶總體灰度值。

1.4 MTT比色法

取對數(shù)生長期的BON-ELF4和BON-Vector細胞，用胰酶消化制成單細胞懸液，通過細胞計數(shù)調整細胞濃度為3×104/mL，取200 μL細胞每孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板內，共設置3個復孔，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度孵箱內培養(yǎng)。每間隔24 h，在超凈工作臺內每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)4 h，連續(xù)測定6 d。用5 cc的注射器小心的吸去培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO 置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。最后，在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值A570nm。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染色結合流式細胞術檢測細胞凋亡

將各組細胞置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培養(yǎng)處理24 h后，去除培養(yǎng)基，隨后分別用0.25%胰酶對細胞進行消化，采用DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，800g離心5 min，棄去上清。采用1×PBS重懸細胞并計數(shù)，收集5×105細胞。加入500 μL的凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）中提供的緩沖液懸浮細胞后，加入5 μLAnnexin V-FITC 混勻，再加入5 μL碘化丙錠（PI），混勻，室溫避光反應10 min。然后用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm，Annexin V-FITC 的綠色熒光通過FITC 通道（FL1）檢測；PI 紅色熒光通過PI 通道（FL3）。熒光補償調節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。采用FlowJo 7.6軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

本研究實驗數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS25.0進行統(tǒng)計學分析，定量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 建立了ELF4高表達的人胰島素瘤細胞BON-ELF4

應用逆轉錄病毒載體表達系統(tǒng)，構建ELF4穩(wěn)定高表達人胰島素瘤細胞系BON。Western blot顯示BONELF4細胞中ELF4蛋白表達量高于對照組細胞BONVector（P=0.013，圖1），穩(wěn)定高表達外源性ELF4蛋白的細胞系BON-ELF4構建成功。

圖1 建立ELF4穩(wěn)定高表達的胰島素瘤細胞BON細胞模型Fig.1 Establishment of BON-ELF4 cell line that stably overexpresses ectopic ELF4.A:Western blotting for detecting ELF4 in BON cells.B:Quantitative analysis of EFL expression using Quantity One software.*P=0.013 vs BON-Vector group.

2.2 高表達ELF4能促進人胰島素瘤細胞增殖

實驗結果顯示，從第3 天開始，相比較于BON 細胞，穩(wěn)定高表達ELF4的細胞系BON-ELF4生長明顯較快（P<0.01，圖2）。

圖2 MTT 法檢測胰島素瘤細胞BON-ELF4 和BON-Vector的生長曲線Fig.2 Growth curves of BON-ELF4 cells and BONVector cells generated based on the results of MTT assay(**P<0.01 vs BON-Vector group).

2.3 高表達ELF4能增強人胰島素瘤細胞抗凋亡能力

采用抗腫瘤化療藥物表阿霉素（EPI）作為凋亡誘導劑，根據(jù)EPI的對各種腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度IC50，以及我們的預實驗參考結果，發(fā)現(xiàn)選定0.1 μmol/L 作用24 h后可有效誘發(fā)BON-Vector腫瘤細胞的凋亡。而后通過免疫印跡法檢測caspase 激活情況，相比較于載體對照組BON-Vector，BON-ELF4 細胞在0.1 μmol/L EPI 處理24 h 后caspase-8、caspase-9 蛋白前體降低，而caspase-8、caspase-9 成熟體切割帶增強（P<0.05，圖3）。同時，相應的PARP切割帶隨著ELF4的高表達而降低（P<0.05，圖3）。采用Annexin V-FITC/PI染色結合流式細胞術分析，結果顯示，在0.1 μmol/L EPI處理各組細胞24 h后，22.90%的載體對照組BON-Vector細胞呈現(xiàn)出Annexin V陽性、PI陰性的早期凋亡結果，6.03%的BON-ELF4細胞組呈現(xiàn)出Annexin V陽性、PI陰性的早期凋亡結果（圖4）。

圖3 EPI處理的各組腫瘤細胞中caspase-8、caspase-9及PARP的表達水平Fig.3 Expression cleaved caspase-8,caspase-9 and PARP in BON-ELF4 cells and BON-Vector cells following epirubicin treatment.

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染色結合流式細胞術檢測各組腫瘤細胞凋亡情況Fig.4 Epirubicin-induced apoptosis of BON-Vector and BON-ELF4 cells analyzed using flow cytometry with annexin V-FITC/PI staining.

2.4 ELF4能夠激活胰島素瘤細胞內Akt信號轉導通路

檢測BON-ELF4和BON-Vector細胞中Akt的磷酸化水平結果顯示，與載體轉導對照細胞相比，外源高表達ELF4的腫瘤細胞中Akt的磷酸化升高（P<0.05），而Akt總蛋白的水平基本未受影響（P>0.05，圖5）。

圖5 胰島素瘤細胞BON-ELF4和BON-Vector細胞中Akt磷酸化水平Fig.5 Expressions of phosphorylated Akt and total Akt in BON-ELF4 cells and BON-Vector cells.

3 討論

本研究證明了ELF4可促進胰島素瘤細胞的增殖以及抵抗凋亡，并闡明其作用機理為激活了腫瘤細胞內Akt信號轉導通路，可為胰島素瘤的診斷預后標志或治療靶點提供科學依據(jù)和理論基礎。

ELF4屬于ETS轉錄因子家族成員，能作為轉錄因子結合在IL-8、perforin、GM-CSF及IL-3等基因的啟動子上，而啟動基因表達［11］。研究表明，在小鼠的Elf4基因敲除后，并不會使得小鼠在胚胎期死亡。這提示ELF4或許是功能冗余，或許是在生理生化及發(fā)育過程中起到一定的作用［11,12］。另外，ELF4還能與細胞內蛋白相互作用，在機體天然免疫中起到調控作用，細胞靜息狀態(tài)下，ELF4以非活性狀態(tài)游離于細胞質中，當PRRs識別病原體后，誘導位于內質網(wǎng)上的接頭蛋白STING與ELF4的C端發(fā)生相互作用，并招募TBK1繼而磷酸化ELF4，隨后激活狀態(tài)的ELF4轉移到核內，進而增強了IRF3，IRF7以及p65與EICE的親和力，最終促進I型干擾素的產(chǎn)生［13］。目前發(fā)現(xiàn)I型和II型干擾素通路的激活均是抗腫瘤免疫的重要環(huán)節(jié)［14,16］，本研究發(fā)現(xiàn)ELF4可激活腫瘤細胞內Akt通路，而以往研究報道PI3K/Akt通路也是I型干擾素的產(chǎn)生的關鍵通路［17,18］。由此提示，ELF4可能可以通過Akt通路激活I型、II型或者III型干擾素的產(chǎn)生，亟待深入研究。因此，ELF4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤免疫系統(tǒng)中都扮演著非常重要的作用。

目前在腫瘤研究領域，ELF4作為抑癌或者促癌的研究都有報道。ELF4是腫瘤惡性轉化不可或缺的因子，研究發(fā)現(xiàn)在Elf4（-/-）p53（-/-）的胚胎成纖維細胞（MEF）中，甚至癌基因H-Ras(V12)或者c-myc均不能使得MEF惡性轉化［10］。其調控細胞惡性轉化的分子機制主要是通過促進Mdm2 的表達，下調P53 依賴的反應，抑制INK4a的激活，從而導致Rb蛋白的磷酸化。研究表明，MDM2的磷酸化是其從細胞質移位進入細胞核的關鍵，MDM2需要定位到細胞核內才能與p53相互作用，而MDM2的磷酸化主要依賴與Akt激酶［19,20］，本研究發(fā)現(xiàn)ELF4可激活Akt通路，因此提示ELF4可能是MDM2重要上游調節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)ELF4在神經(jīng)膠質母細胞瘤中異常高表達，其可通過直接激活機體細胞內Sox2的表達從而賦予其干細胞特性，促使神經(jīng)膠質母細胞瘤的形成［21］。也有研究發(fā)現(xiàn)ELF4在卵巢癌中呈上調表達，并且通過體外及體內實驗證明ELF4能促進卵巢癌細胞過度增殖，能夠在裸鼠體內促進卵巢癌失控性生長［22］。然而在急性髓性白血病中，ELF4則是作為一個抑癌基因起作用［23］。本研究發(fā)現(xiàn)ELF4高表達可以促進人胰島素瘤細胞增殖，同時增強人胰島素瘤細胞抗凋亡能力，并闡明其機理是通過激活Akt通路而促進胰島素瘤細胞增殖和抗凋亡。由此說明ELF4的功能具有一定的多樣性，在不同類型腫瘤中，由于ELF4定位在細胞質或細胞核中而發(fā)揮功能的差異性，可能激活完全不同的信號轉導通路，而其原因可能是在細胞內相互結合的關鍵蛋白因子不同。圍繞ELF4的精細調控信號轉導通路的主題，本課題組擬將繼續(xù)深入探究。本研究為闡明ELF4在胰島素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機理提供新的線索，并為胰島素瘤的診斷預后標志或治療提供可能的新靶點。