熊 劍，油 珅，長孫東亭，李曉丹，羅素蘭

（海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點實驗室/海口市海洋藥物重點實驗室，?？?570228）

嗎啡在臨床上是效果良好的止痛藥，用于治療慢性疼痛，但是反復(fù)使用會導(dǎo)致成癮，這極大地限制了它在臨床上的應(yīng)用[1]。此外，全球因使用嗎啡導(dǎo)致成癮的人越來越多，嚴重危害了個人身體健康和公共衛(wèi)生安全[2]。目前，國內(nèi)外研究嗎啡成癮的方法有很多，包括條件性位置偏愛模型[3?4]、自身給藥模型[5?6]及行為敏化模型等[7?9]。條件性位置偏愛（CPP）模型具有周期短、操作簡單的特點，被廣泛用于研究藥物成癮，是研究藥物濫用的經(jīng)典動物模型。運用巴普洛夫反射原理，通過小鼠在伴藥箱停留的時間多少，來反映小鼠對濫用藥物的渴求程度，也是一種經(jīng)典的篩選抗成癮藥物的動物模型[10]。CPP模型的建立有很多影響因素，如給藥方法（增量法、恒量法）、恒量法中的嗎啡濃度（5、10、20 mg·kg?1）[11?13]、嗎啡注射次數(shù)（3、4、6次）[14?15]、給藥方式（皮下注射，腹腔注射）[16?17]、給藥時程間（6、8、10 d）、訓(xùn)練時間（30、40、50 min）的選擇；CPP箱體個數(shù)的差異（三箱式、兩箱式）；CPP箱體環(huán)境的差異（箱壁顏色、箱底紋理）及動物種類（小鼠種類、大鼠種類）[18]等都會影響CPP模型建立的效果。在恒量嗎啡給藥中，不同研究存在嗎啡給藥時間間隔上的差異[19?20]，主要有24 、48 h，目前這兩種方法間的差異尚未見報道。本研究針對不同給藥時間間隔對嗎啡誘導(dǎo)小鼠CPP模型的影響，比較建立模型前后小鼠在各箱的停留時間和CPP模型的消退情況，對嗎啡誘導(dǎo)CPP模型進行綜合評價，為后續(xù)抗嗎啡成癮藥物的篩選提供整體動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥物本實驗動物為C57BL/6J小鼠，6周齡，雄性，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【許可證號：SCXK(湘)2016—0002】，在標準環(huán)境（8：00—20：00明暗交替）下分籠飼養(yǎng)，每籠6只，讓小鼠任意取食水和食物。實驗開始前，給小鼠1周的時間適應(yīng)實驗室環(huán)境。實驗隨機分為4組，分別為生理鹽水組（24 h），生理鹽水組（48 h），嗎啡組（24 h）和嗎啡組（48 h），每組12只小鼠。硫酸嗎啡由中國藥品生物制品檢定所提供（批號171201-200521）。

1.2 實驗儀器條件性位置偏愛箱（Anilab浙江寧波）：是三箱式條件性位置偏愛箱，分為兩側(cè)箱和中間箱。兩側(cè)箱大小相等(長 × 寬 × 高=17.38 cm × 13.5 cm × 15 cm)，左側(cè)箱為白箱，有白色的箱壁和圓孔地板，右側(cè)箱為黑箱，有黑色的箱壁和柵欄樣地板。中間箱為連通箱，大小為（9.8 cm × 13.5 cm × 15 cm）。透明有機玻璃擋板可以放在中間箱中，將小鼠限制在相應(yīng)的箱體里面。箱體上方有攝像頭，用于記錄實驗期間小鼠的運動情況。偏愛箱放置于小型的隔音室里，避免聲音對實驗的干擾。

1.3 CPP模型的建立

1.3.1 基礎(chǔ)值期基礎(chǔ)值指造模前小鼠在伴藥箱停留的時間。基礎(chǔ)值期前一天捉拿小鼠，用針頭輕輕摩擦小鼠頸背部皮膚，消除小鼠在皮下注射過程中產(chǎn)生的恐懼情緒。在基礎(chǔ)值期，將小鼠頭朝同一方向放入中間箱后，讓小鼠自由地在3個箱體中穿梭，記錄小鼠15 min內(nèi)在每個箱體里停留的時間，每天1次，共3 d，取后2 d 的平均值作為基礎(chǔ)值，選取左右2箱中時間較少的箱體為伴藥箱，另一側(cè)箱體為非伴藥箱，篩除對于特定箱體存在自然偏愛的小鼠（在某一箱體的時間大于540）。

1.3.2 造模期用透明玻璃擋板封閉中間箱，使小鼠只能在特定的箱體里活動。嗎啡組（24 h）小鼠，上午8：30注射嗎啡（5 mg·kg?1）后立刻放入伴藥箱40 min，下午2：30注射生理鹽水后放入非伴藥箱40 min，每天2次注射，連續(xù)給藥4 d。嗎啡組（48 h）小鼠，上午8：30給藥，1、3、5、7 d給嗎啡（5 mg·kg?1），2、4、6、8 d給生理鹽水，每天注射1次，連續(xù)給藥8 d。生理鹽水組（24 h）和生理鹽水組（48 h）操作與時間間隔相同的嗎啡組的操作相同，將嗎啡換為生理鹽水。

1.3.3 表達期造模期結(jié)束后，第二天將小鼠放入中間箱，讓其自由穿梭15 min，記錄各組小鼠在伴藥箱停留的時間，計算CPP得分，觀察各組對伴藥箱的偏好情況。CPP得分（CPP scores）= CPP造模后在伴藥箱停留的時間?造模前在伴藥箱停留的時間。

1.3.4 消退期篩選造模成功的小鼠進行消退，觀察CPP模型的持續(xù)時間，采用半訓(xùn)練消退的方式檢測，讓小鼠每天在條件性位置偏愛箱中自由穿梭15 min，觀察小鼠在伴藥箱停留的時間，直到小鼠在伴藥箱的停留時間與基礎(chǔ)值相差不超過20%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果通過平均值 ± 標準誤（Mean ± SEM）表示，根據(jù)實際數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Dunnett’s Multiple Comparison Test檢驗分析或雙因素方差分析（two-way ANOVA），Bonferroni post tests檢驗分析，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同給藥時間間隔對CPP模型建立的影響CPP造模前后小鼠在伴藥箱停留時間見表1，結(jié)果表明，造模前各組小鼠在伴藥箱停留時間無明顯差異，經(jīng)多次皮下注射嗎啡后，與生理鹽水組（24 h）相比，嗎啡組（24 h）小鼠在伴藥箱的時間極顯著增加（P< 0.001）；與生理鹽水組（48 h）相比，嗎啡組（48 h）小鼠在伴藥箱的時間也極顯著增加（P< 0.001）。計算CPP得分，結(jié)果見圖1。通過單因素方差分析，與生理鹽水組相比，嗎啡組24 h和48 h組的CPP得分均明顯增加，但二者之間無顯著性差異，兩種方法都能成功建立CPP模型。

圖1 不同給藥時間間隔對CPP得分的影響Fig. 1 The effect of different intervals of drug administration on CPP score

表1 不同給藥時間間隔對CPP模型建立的影響Tab. 1 The effect of intervals of drug administration on establishment of conditioned place preference (CPP) model

2.2 不同給藥時間間隔對CPP模型消退的影響CPP表達期以后第2天進行消退訓(xùn)練，比較2種給藥時間間隔建立CPP模型后的維持情況。每天進行1次15 min的測試。結(jié)果（圖2）表明，前3 d內(nèi)，兩組小鼠在伴藥箱的停留時間差別不大，說明短期（3 d）內(nèi)時間間隔為24 h和48 h時建立的CPP模型無差別；從第4 天開始，嗎啡組（24 h）小鼠在伴藥箱停留的時間開始變小，出現(xiàn)消退情況（伴藥箱時間與基礎(chǔ)值的差值為基礎(chǔ)值的20%以內(nèi)），6～10 d時，消退情況較多，但消退情況不穩(wěn)定（前天消退，后天又恢復(fù)）到10 d時大部分小鼠（8/12，約66%）消退且穩(wěn)定，而嗎啡組（48 h）小鼠在伴藥箱的時間一直維持在440 s左右，10 d時，只有少部分（3/12，約25%）小鼠的CPP恢復(fù)至基礎(chǔ)值左右，在6 d和10 d時，伴藥箱的時間顯著高于嗎啡組（24 h）的時間（F(9，220)= 7.23；6 d，t=3.000，P<0.05；10 d，t=2.947，P< 0.05），這表明給藥間隔時間為24 h建立的CPP模型維持時間短、易被消退；對嗎啡組（48 h）小鼠繼續(xù)測試7 d，結(jié)果見圖3。從圖3可見，嗎啡組（48 h）在11～13 d時伴藥箱內(nèi)停留依然保持較高水平，與基礎(chǔ)值相比具有極顯著差異（P< 0.001），在第14天時出現(xiàn)消退情況，到第16天后部分（5/12，42%）小鼠被消退，所以嗎啡給藥間隔48 h建立的CPP模型可以維持15 d。

圖2 不同給藥時間間隔對CPP模型消退的影響Fig. 2 The effect of intervals of drug administration on the extinction of the mouse CPP

圖3 11～17 d內(nèi)嗎啡組（48 h）的消退情況Fig. 3 The extinction of mouse preference behavior in the morphine group (48 h) in 11-17 days

3 討 論

本研究探究了不同給藥時間間隔（24、48 h）對5 mg·kg?1嗎啡在C57BL/6J小鼠上建立CPP模型的影響。結(jié)果表明，5 mg·kg?1的嗎啡能誘導(dǎo)CPP模型的建立，與文獻[21]結(jié)果一致，嗎啡給藥間隔24 h建立的CPP模型與給藥間隔48 h的相比，在3 d內(nèi)伴藥箱時間無明顯變化，說明2種方法均能建立穩(wěn)定的CPP模型。復(fù)吸是研究藥物依賴的一個重要方面，而消退過程是復(fù)吸的前提，因此本研究也評估了CPP模型的消退，為后續(xù)嗎啡成癮中濫用藥物的復(fù)吸（復(fù)發(fā)）研究奠定基礎(chǔ)。CPP的消退是讓小鼠反復(fù)的進入伴藥箱（環(huán)境刺激）而不給予濫用藥物（條件刺激），從而讓小鼠對伴藥箱的偏愛逐步消退的過程。本研究采用半訓(xùn)練消退的方法[22]，每天將小鼠放入CPP箱中15 min，讓其自由穿梭，連續(xù)9 d。結(jié)果表明，嗎啡給藥間隔24 h的CPP模型可以維持5 d，在10 d時大部分（8/12，約66%）小鼠已經(jīng)穩(wěn)定消退到基礎(chǔ)值水平，而嗎啡給藥間隔48 h的CPP模型可以維持15 d，在第10 天時僅少量（3/12，約25%）小鼠消退，在第16 天時部分（5/12，42%）小鼠消退。所以給藥間隔48 h的CPP模型維持時間更久，不容易被消退。這與前人研究報道的同劑量下增加給藥時間間隔能有效提高嗎啡誘導(dǎo)CPP模型穩(wěn)定性的結(jié)果一致[23]。

嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛形成以后，動物會產(chǎn)生心理渴求和強制性覓藥行為，這種覓藥行為的形成與藥物獎賞，突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，神經(jīng)可塑性以及與藥物依賴相關(guān)的畸形記憶息息相關(guān)。目前研究較多的是獎賞通路和神經(jīng)突觸的可塑性變化，獎賞通路涉及多個腦區(qū)（中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、伏隔核、海馬、前額葉皮質(zhì)）的神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸、多巴胺、5-羥色胺、γ-氨基丁酸等）轉(zhuǎn)運[24?26]，其中主要是中腦腹側(cè)被蓋區(qū)到伏隔核的多巴胺投射通路。突觸可塑性變化，表現(xiàn)為腦內(nèi)突觸樹突分支樹突棘密度的變化，突觸間信息傳輸出現(xiàn)長時程增強（long term potential，LTP）和長時程抑制（long term depression，LTD）效應(yīng)[27]，前者涉及NMDA和mGluR受體激活，鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）和一氧化氮合酶（nNOS）激活[28]，引起細胞級聯(lián)反應(yīng)[29]，調(diào)控基因表達[30]，后者與炎癥因子和神經(jīng)元細胞的凋亡[31]，兩者一起參與嗎啡成癮的病理過程。給藥時間間隔對可塑性的影響尚未見報道，給藥時間間隔可能也會影響上述通路而參與CPP模型的建立。

綜上所述，在嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛中，在短期實驗內(nèi)，兩種方法CPP模型建立效果基本一致，給藥的時間間隔越長，建立的CPP模型越穩(wěn)定。在第4天嗎啡給藥，給藥時間間隔為24 h時，經(jīng)過10 d的半訓(xùn)練消退，CPP模型會大部分消退。如果為了研究藥物對復(fù)吸情況的影響，建議選擇時間間隔為24 h，因為該方法建立的CPP模型消退快，在第10天時部分小鼠已經(jīng)完成消退。在第8天嗎啡給藥，給藥時間間隔為48 h時，CPP可以維持15 d。如果實驗為了研究藥物對CPP模型消退的影響，則應(yīng)選擇間隔48 h，這樣不容易出現(xiàn)因?qū)嶒炛袦y試次數(shù)過多而被消退的情況。