占昭宏，林玉暖，米 多，魏炳錚，牛曉磊，陳銀華，陶 均，李春霞

（海南大學(xué) 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/熱帶作物學(xué)院，?？?570228）

水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo)引起的一種破壞性極大的病害,長期以來對水稻的產(chǎn)量造成巨大的損失。在病原菌與水稻的互作過程中，水稻細(xì)胞可識別來自病原菌的信號分子從而觸發(fā)免疫防御，而病原菌也進(jìn)化出特殊的機(jī)制來抑制或逃脫宿主產(chǎn)生的免疫反應(yīng)而成功侵染。在此過程中，由Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ Secretion System, T3SS)分泌的效應(yīng)因子(Type Ⅲ Secretion Effectors, T3SEs)起到關(guān)鍵性的作用。一方面，部分T3SEs可抑制植物細(xì)胞的天然免疫途徑而起到促進(jìn)細(xì)菌侵染的作用；另一方面，植物進(jìn)化出了一些新防御策略：植物細(xì)胞可識別部分T3SEs而觸發(fā)免疫反應(yīng)，限制病原菌的侵染。在反復(fù)的斗爭過程中，細(xì)菌又進(jìn)化出了部分T3SEs來抑制由效應(yīng)因子激活的免疫反應(yīng)。此過程循環(huán)往復(fù)，病原菌與植物協(xié)同進(jìn)化，共同決定病原菌與植物的關(guān)系[1?2]。因此，解析T3SE的功能及調(diào)控途徑對理清病原菌?植物的互作關(guān)系至關(guān)重要。通過泌出信號肽氨基酸組成、保守結(jié)構(gòu)域與結(jié)構(gòu)的無序性、HrpX和HrpG是否調(diào)控、GC含量和密碼子偏好性以及同源性等分析是預(yù)測效應(yīng)蛋白的主要手段[3]。Xoo中有2類T3SEs：一類是轉(zhuǎn)錄激活子類效應(yīng)蛋白(Transcription Activation-Like Effectors, TALEs)，可與水稻易感性基因啟動子的結(jié)合調(diào)控宿主基因表達(dá)[4?6]，但并不是所有Xoo菌株都有TALE。另一類是非TALE效應(yīng)因子。這類T3SEs結(jié)構(gòu)多變，功能多樣。XooPXO99A中，共有19個(gè)TALEs以及32個(gè)非TALE效應(yīng)因子。在TALE類效應(yīng)因子中，PthXo1、PthXo2和PthXo3的功能被研究得比較清晰[7?11]。在32個(gè)非TALE效應(yīng)因子中，9個(gè)(XopK、XopP、 XopR、 XopY、 XopZ、XopN、XopF、XopV和XopAA)的功能已被研究，被認(rèn)為參與PTI途徑(pathogen-associated molecular pattern triggered immunity)，抑制活性氧以及調(diào)控細(xì)胞壁參與的免疫響應(yīng)等過程[12?13]，但是其中絕大多數(shù)的分子機(jī)制仍然不清楚[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了轉(zhuǎn)錄因子HrpG，HrpX調(diào)控效應(yīng)因子XopAY的表達(dá)情況和xopAY缺失對Xoo致病力的影響，旨在為水稻白葉枯病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料XopAY蛋白序列下載于NCBI，PXO99A為本實(shí)驗(yàn)室保存；化學(xué)試劑購自廣州化學(xué)試劑公司和Sigma-Aldrich；PCR試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由上海生工生物科技有限公司合成；限制性內(nèi)切酶及高保真酶購自NEB China。本實(shí)驗(yàn)的引物見表1，所用菌株和質(zhì)粒見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)引物Tab. 1 Primer sequences

表2 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒Tab. 2 Bacterial strains and plasmids

1.2 基因敲除及致病力分析缺失突變體構(gòu)建及Xoo致病力參照以前發(fā)表的方法[15]。PCR擴(kuò)增xopAY上下游各約500 bp片段，上下游片段分別用HindⅢ/BamHⅠ和BamHⅠ/EcoRⅠ酶切回收后連接HindⅢ/EcoRⅠ酶切的pK18mobsacB，測序正確后通過電擊法轉(zhuǎn)入PXO99A中，兩步交換后通過PCR驗(yàn)證獲得相應(yīng)突變體。Xoo菌株致病力分析采用剪葉法，水稻為60 d IR24苗，每個(gè)菌株接種10片葉，14 d后觀察發(fā)病情況并量病斑長度。

1.3 互補(bǔ)菌株的構(gòu)建PCR擴(kuò)增全長xopAY，通過無縫克隆的方式連接到pHM1載體（HindⅢ/EcoRⅠ酶切）上，測序正確后電擊轉(zhuǎn)化?xopAY，利用壯觀霉素篩選轉(zhuǎn)化子，PCR分析是否轉(zhuǎn)化成功[16]。

1.4 RNA提取及RT-qPCR分析PXO99A、?hrpG、?hrpX接種于PSA培養(yǎng)基中（w=1%牛肉膏，w=1%酵母提取物，w=1%蔗糖）中，28 ℃培養(yǎng)18 h后，離心收集菌體，將培養(yǎng)基換成Ⅲ型分泌系統(tǒng)誘導(dǎo)型培養(yǎng)基XOM2（0.18% Xylose，670 mmol·L?1Mothionine，10 mmol·L?1sodium glutamate，14.7 mmol·L?1KH2PO4，40 μmol·L?1MnSO4，240 μmol·L?1Fe(Ⅲ)-EDTA，5 mmol·L?1MgCl2，pH6.5），在28 ℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，離心收集菌體，液氮速凍后進(jìn)行RNA提取。RNA提取采用TIANGEN公司RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取盒，提取方法參照試劑盒說明書提取。反轉(zhuǎn)錄采用Thermo公司的maxima H minus First Strand cDNA synthnesis Ki。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR和RT-PCR。qPCR試劑用Vazyme公司的ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix。以gyrB基因?yàn)閮?nèi)參。qPCR引物見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析及作圖接種數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5作圖，圖像后期處理用Adobe Photoshop 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 XopAY的生物信息學(xué)分析植物病原菌T3SEs大多受轉(zhuǎn)錄因子HrpG和HrpX調(diào)控。HrpG激活hrpX的轉(zhuǎn)錄，HrpX結(jié)合到植物誘導(dǎo)啟動子盒（plant inducible promoter，PIP-box）上促進(jìn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。HrpX結(jié)合的保守序列特征是：TTCGB-N(15)-TTCGB-N(30-32)-YANNRT (B代表C、G、T；Y代表C、T；R代表A、G、T)。通過分析發(fā)現(xiàn)，xopAY啟動子區(qū)域有1個(gè)保守的PIP-box及HrpX結(jié)合位點(diǎn)（圖1-A），暗示xopAY可能是T3SEs。

圖1 XopAY為預(yù)測的T3SEFig. 1 XopAY is a putative T3SE

T3SEs蛋白通常由2部分組成：N端分泌轉(zhuǎn)運(yùn)信號區(qū)（在前50氨基酸內(nèi)）和C端功能區(qū)域。在XopAY的蛋白序列中，N?端第3個(gè)氨基酸序列為P氨酸，且脯氨酸和絲氨酸占N?端前50個(gè)氨基酸的百分比為18%，N?端前12位沒有天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）（圖1-B），這些符合Ⅲ型效應(yīng)蛋白的特征[3,17]。此外，XopAY不含有轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)構(gòu)域。以上分析說明，XopAY應(yīng)該為典型的非TALE類T3SE。

2.2 xopAY的表達(dá)受HrpG和HrpX調(diào)控由于xopAY啟動子含有保守的PIP-box，為此推測其表達(dá)受HrpG和HrpX調(diào)控。因此，筆者分析了野生型、hrpG和hrpX突變體中xopAY的表達(dá)情況。RT-qPCR)和反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）結(jié)果顯示，突變hrpG和hrpX均導(dǎo)致xopAY表達(dá)量急劇降低（圖2A），xopAY在野生型中的表達(dá)量約是突變體ΔhrpG和ΔhrpX中的5倍，且RT-PCR的結(jié)果顯示，xopAY在ΔhrpG和ΔhrpX的PCR條帶相對在野生型中暗淡和微弱（圖2B）。說明XopAY在Xoo中的表達(dá)受HrpG和HrpX正調(diào)控[18]。

圖2 HrpG和HrpX正調(diào)控xopAY的表達(dá)Fig. 2 xopAY expression is positively regulated by HrpG and HrpX

2.3 XopAY調(diào)控Xoo與水稻的互作上述實(shí)驗(yàn)說明XopAY為T3SE。通常T3SE通過調(diào)控宿主細(xì)胞功能來影響病原菌與宿主的互作，因此，筆者檢測了xopAY突變對XooPXO99A致病力的影響。如圖3A所示，接種后病斑長度越長代表致病力越強(qiáng)，與野生型PXO99A相比，xopAY缺失突變體致病力顯著下降。通過互補(bǔ)分析發(fā)現(xiàn)，反式導(dǎo)入xopAY可以恢復(fù)ΔxopAY的致病力到野生型水平（圖3B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，XopAY對Xoo侵染水稻非常重要。

圖3 XopAY參與Xoo與水稻的互作Fig. 3 Pathogenicity analysis of PXO99A, ΔxopAY, and C-ΔxopAY

3 討 論

本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測了XopAY作為Xoo候選效應(yīng)因蛋白，通過構(gòu)建xopAY的缺失突變體以及回補(bǔ)菌株對水稻葉片進(jìn)行接種，發(fā)現(xiàn)XopAY在Xoo侵染水稻的過程中起到至關(guān)重要的作用，在缺失xopAY的情況下，Xoo的致病能力顯著下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了xopAY受T3SS的重要調(diào)控因子HrpG和HrpX的調(diào)控。這些結(jié)果表明，XoPAY對Xoo的成功侵染起重要作用。雖然在不同病原菌中有很多效應(yīng)因子被報(bào)道參與其致病過程，且機(jī)制清晰[12?17]，但XoPAY蛋白鮮見報(bào)道，說明其為新型效應(yīng)因子，具體功能尚不清楚。此外，XopAY通過干預(yù)水稻細(xì)胞的何種信號或代謝途徑進(jìn)而影響病原菌的致病力仍然未知。今后還有侍鑒定XopAY的生化活性，分析其影響植物細(xì)胞功能的方式、途徑及調(diào)控機(jī)制，以便進(jìn)一步解析Xoo與水稻的互作機(jī)制。