高效液相色譜法測定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法研究

◎ 劉 霞

（六安市食品藥品檢驗中心，安徽 六安 237000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）又稱為嘔吐毒素，是鐮刀菌的次要的生產(chǎn)代謝的產(chǎn)出物，性質(zhì)十分穩(wěn)定，且具有一定的耐熱、耐壓及耐弱酸和耐儲藏的特點，所以在普通的食品加工過程中，一般情況下無法破壞其本身結(jié)構(gòu)，如果對其加入堿或者是進行一些特殊的高壓步驟，則會破壞其中的一些毒素。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是糧食檢測中十分重要的安全指標，是糧食中十分危險的自然污染物之一[1]，分布特別廣泛，因此小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的存在不可避免，當人們誤食了含有DON的食物時，往往會出現(xiàn)厭食、嘔吐、腹瀉等中毒癥狀，有情況嚴重者甚至可能會死亡。由于其具有一定的危害性，對此各個國家都制定了一系列嚴格的限量標準。比如加拿大規(guī)定，牛和雞的飼料中DON含量不能超過5 mg·kg-1，在豬和小牛的飼料當中不能超過1 mg·kg-1；澳大利亞規(guī)定了黑麥當中的DON含量不可超過0.5 mg·kg-1；我國規(guī)定了谷物當中的DON含量不能超過1.0 mg·kg-1。

伴隨著人們食品安全意識的提高，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的相關檢測工作也得到了重視，因此脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢測方法的相關報道也在不斷增加。常用的檢測方式有4種，包括同位素稀釋液相色諧-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫親和層析凈化高效液相色譜法、薄層色譜測定法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法。目前，免疫親和層析凈化高效液相色譜法是一種最為有效也最能準確定量的檢測方法，通過免疫性親和柱可以把脫氧雪腐鐮刀菌烯醇更好地從谷物和相關制品中進行有效分離，凈化效果明顯。但是此方法種前處理的相關研究報道十分稀少，本次實驗選擇了適用于多種類別食品檢測的免疫親和層析凈化-高效液相色譜法，研究了小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定的線性范圍及回收率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售小麥粉；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱；色譜純甲醇、乙腈。

1.2 儀器與設備

島津LC-20A高效液相色譜儀；紫外檢測器；臺式高速離心機；超聲波清洗儀；固相萃取裝置；氮吹儀

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

稱取小麥粉25 g置于100 mL離心管中，加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混合均勻，置于超聲波清洗儀中超聲20 min，后放入離心機，10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。取上清液2 mL過脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱，然后使用磷酸鹽緩沖溶液和水進行淋洗，加入2.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，50 ℃下氮氣吹至近干，加入1.0 mL初始流動相，溶解殘渣，渦旋混勻，過濾膜，待測[2]。

1.3.2 色譜條件

色 譜 柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶水=20∶80；紫外檢測器：檢測波長218 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫35 ℃。

1.3.3 回收率的測定

稱取6組空白樣品，分別加入不同含量的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品，按照1.3.1的方法進行前處理操作，采用免疫親和層析凈化-高效液相色譜法對樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量進行測定，計算加標回收率。

2 結(jié)果分析

2.1 標準曲線的繪制

經(jīng)液相色譜紫外檢測器測定，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的保留時間為 9.312 min，在 0.1 ～ 5.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系較好，線性方程為：y=76 368.1x+1 286.80，相關系數(shù)R=0.999 9。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液的色譜圖見圖1，標準曲線見圖2。

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準溶液的色譜圖

圖2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的標準曲線圖

2.2 免疫親和層析凈化法的加標回收率

采用免疫親和柱進行凈化，按照前述處理方法及儀器測定條件，測定不同加標量的回收率，加標樣品的色譜圖及回收率測定結(jié)果分別見圖3和表1。

圖3 加標樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的色譜圖

表1 不同加標量的回收率表

3 結(jié)論

本文采用免疫親和層析凈化高效液相色譜法，對小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量進行了測定。實驗結(jié)果表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在0.1～5.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系較好。而回收率在不同添加濃度上存在一定差別，可能是提取液在免疫親和柱上的流速不同導致的[3]。

免疫親和柱的作用原理是根據(jù)抗原抗體的特異性進行結(jié)合[4]，在柱體中加入可以與特異性抗體相結(jié)合的凝膠物質(zhì)，將待測物吸附出來。待測提取液需緩緩均勻地經(jīng)過凈化柱，在提取液完全經(jīng)過柱體后，再對該柱體進行抽干，最后加入洗脫液進行淋洗洗脫。在此過程中，若提取液在柱體表面流動過快，免疫親和柱中的特異性抗體就不能及時和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇相結(jié)合，被吸附的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的數(shù)量比實際數(shù)量少，實驗的結(jié)果就會偏低。本次實驗對小麥粉進行了相應的研究，但是相比于其他食品，如大米，食用性植物油等產(chǎn)品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[5]含量的檢測仍需進一步研究才能確定。

對于檢測數(shù)量稀少的樣品，需要通過均質(zhì)法進行樣品前處理，這樣能夠達到快速和準確檢測的效果。對大批量樣品的檢測工作而言，通過振蕩提取的方式不僅能夠保證實驗的準確性，也節(jié)省了實驗的時間成本。同時，樣品的細度對于樣品檢測的結(jié)果影響也很大，在樣品經(jīng)過了研磨以后，篩子的孔徑過小或是過大，都會導致目標物提取不充分。因此，應當選擇恰當?shù)暮Y子孔徑。