◎ 鄭麗婷，王瑞恒，樂(lè)虹雯，陳杏洲

（武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205）

啤酒是以麥芽和水為主要原料，并添加啤酒花、酵母發(fā)酵而成的一種發(fā)酵酒，因其口感清爽、香氣宜人而受到人們的喜愛(ài)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)所售的國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)啤酒中嘌呤含量普遍較高[2]，該物質(zhì)在人體中最終代謝為尿酸，尿酸若在體內(nèi)大量積累，極易引發(fā)痛風(fēng)[3]。隨著全球啤酒消費(fèi)量的增加，飲用高嘌呤啤酒所帶來(lái)的問(wèn)題也逐漸突顯。

目前，嘌呤類物質(zhì)檢測(cè)方法多采用高效液相色譜法[4]、反相離子對(duì)色譜法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]，其中高效液相色譜法因操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確而廣受青睞。本文旨在建立檢測(cè)啤酒中嘌呤含量的高效液相色譜法，為啤酒樣品中嘌呤的定量檢測(cè)提供參考，促進(jìn)啤酒行業(yè)健康、快速、穩(wěn)定的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，色譜級(jí)（純度≥99.9%），上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、濃硫酸、甲醇，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用超純水，上海和泰儀器有限公司純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），月旭科技（上海）股份有限公司；pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；電子分析天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法

準(zhǔn)確稱取腺嘌呤（A）、鳥(niǎo)嘌呤（G）、次黃嘌呤（H）和黃嘌呤（X）4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，用超純水溶解并定容至25 mL，加入少量氫氧化鈉溶液（10 mol·L-1）助溶，配制成1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用0.45 μm濾膜過(guò)濾，置于4 ℃冰箱冷藏保存，使用時(shí)稀釋到一定的濃度。使用前看是否存在白色懸浮物，若存在需要重新配制。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別取體積相同的上述溶液混合，用超純水稀釋至100 mg·L-1、50 mg·L-1、25 mg·L-1、10 mg·L-1、5 mg·L-1、2.5 mg·L-1和 1.0 mg·L-1，用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制4種嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品前處理

取30 mL啤酒樣品于50 mL離心管中，在5 000 r·min-1下離心15 min，將離心后的啤酒倒入敞口三角燒瓶中，經(jīng)超聲除氣15 min。

取5 mL的除氣啤酒樣品于25 mL的試管中，加入3 mol·L-1的硫酸溶液5 mL，加塞后，立即置于100 ℃恒溫水浴鍋中，在100 ℃下水解10 min，然后迅速冰水浴冷卻。用10 mol·L-1的氫氧化鉀溶液調(diào)整pH到2～8，然后用濾紙過(guò)濾，并用蒸餾水洗滌殘?jiān)?，濾液定容到25 mL，再用0.22 μm濾膜過(guò)濾，濾液進(jìn)入高效液相色譜儀分析。

1.3.4 色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為 0.02 mol·L-1KH2PO4-H3PO4緩沖溶液（pH=3.6）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent 1260高效液相色譜儀自帶數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，本文所有色譜圖和折線圖均使用Origin 2019及Excel軟件繪制，數(shù)據(jù)表示形式、精密度、準(zhǔn)確度結(jié)果均由Excel辦公軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液相條件分析

2.1.1 流動(dòng)相選擇

由色譜分離原理可知，流動(dòng)相的選取直接影響著4種嘌呤的分配比例，進(jìn)而影響混合物的分離效果。陳月菊[7]在測(cè)定食用菌中嘌呤物質(zhì)的含量時(shí)選擇甲醇∶水=5∶95作為流動(dòng)相。程慶紅等[8]在測(cè)定蝦仁和牡蠣中嘌呤類物質(zhì)的含量時(shí)也選擇甲醇∶水=5∶95作為流動(dòng)相，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇濃度高于5%時(shí)，次黃嘌呤和黃嘌呤不能完全分開(kāi)。劉鎮(zhèn)等[9]在測(cè)定黃酒中嘌呤含量時(shí)選擇0.007 mol·L-1的磷酸二氫鉀（pH=4.0）作為流動(dòng)相，且分離效果良好。王靜螢等[10]利用0.02 mol·L-1的磷酸二氫鉀分別測(cè)定了啤酒和肉類中嘌呤的含量。

參考以上色譜條件分別選用甲醇∶水=5∶95、0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）、0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）-甲醇（V∶V=98∶2）、0.008 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=4.5）作為流動(dòng)相，流速均為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，測(cè)定嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品中4種嘌呤的含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同的流動(dòng)相參數(shù)下4種嘌呤的分離效果圖

當(dāng)選擇甲醇∶水=5∶95、0.008 mol·L-1的磷酸二氫鉀（pH=4.5）作為流動(dòng)相時(shí)，鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤出峰時(shí)間幾乎相同；當(dāng)選擇0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）∶甲醇（V∶V=98∶2）溶液作為流動(dòng)相時(shí)，與單純使用緩沖鹽作為流動(dòng)性時(shí)相比，4種嘌呤的保留時(shí)間均減小，但鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤的保留時(shí)間相隔太小，分離效果不好，已有研究發(fā)現(xiàn)向流動(dòng)相中加入甲醇對(duì)樣本中嘌呤的分離影響較小，甚至?xí)狗蛛x效果變差[11-12]；當(dāng)選擇0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀（pH=3.6）作為流動(dòng)相時(shí)，4種嘌呤分離度好，且峰形標(biāo)準(zhǔn)，故選其作為流動(dòng)相。

2.1.2 流動(dòng)相pH選擇

在使用磷酸二氫鉀溶液作為流動(dòng)相時(shí)，不同研究者選用的pH有所差異[13-14]。嘌呤是一種弱堿性物質(zhì)，且有極性，流動(dòng)相的pH會(huì)影響其極性，從而影響其存在形態(tài)。流動(dòng)相pH影響嘌呤在色譜柱中停留時(shí)間和色譜峰形狀，對(duì)4種嘌呤的分離有很大的影響[15]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變磷酸二氫鉀緩沖溶液的pH，探究4種嘌呤在pH為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8和4.0的0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液的流動(dòng)相下的分離情況，結(jié)果如圖2所示。pH在3.0～4.0時(shí)，隨著pH增大，4種嘌呤的保留時(shí)間增長(zhǎng)；pH小于3.6時(shí)腺嘌呤與鳥(niǎo)嘌呤的保留時(shí)間基本重合，無(wú)法分離；當(dāng)pH增大到3.8時(shí)腺嘌呤和次黃嘌呤的保留時(shí)間接近；當(dāng)pH增加到4.0時(shí)次黃嘌呤的出峰時(shí)間延后，與黃嘌呤接近。當(dāng)pH=3.6時(shí)，4種嘌呤分離情況最佳，故確定流動(dòng)相pH為3.6。

圖2 4種嘌呤在不同pH的0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀條件下的分離效果圖

2.1.3 柱溫選擇

柱溫也會(huì)影響色譜柱的分離效果。對(duì)液相色譜來(lái)說(shuō)，色譜柱處于較高溫度的環(huán)境下可以加快樣本中嘌呤混合物的分離速度，但分辨率和待分離物質(zhì)的保留時(shí)間均會(huì)受到影響。本實(shí)驗(yàn)研究了柱溫為22 ℃、25 ℃、28 ℃和30 ℃時(shí)4種嘌呤的分離效果，結(jié)果如圖3所示。在本實(shí)驗(yàn)所研究的溫度范圍內(nèi)，溫度越低，保留時(shí)間越長(zhǎng)。當(dāng)溫度大于25 ℃時(shí)，腺嘌呤和次黃嘌呤分離度不高，是因?yàn)楫?dāng)溫度升高時(shí)，各組分的分配系數(shù)變小，分離度隨之減小，越不好分開(kāi)；當(dāng)溫度小于25 ℃時(shí)，鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤沒(méi)有完全分離，分離效果差，故選擇柱溫為25 ℃。

圖3 4種嘌呤在不同溫度下的分離程度圖

2.1.4 波長(zhǎng)選擇

4種嘌呤具有較強(qiáng)的紫外吸收特性。在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，對(duì)4種嘌呤混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖4所示。掃描結(jié)果顯示腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤及次黃嘌呤最大吸收波長(zhǎng)分別為268 nm、274 nm、277 nm和259 nm。目前測(cè)定嘌呤類物質(zhì)時(shí)多選擇254 nm波長(zhǎng)[16-17]，但也有研究者選擇了其他波長(zhǎng)[18-19]，測(cè)定結(jié)果差異不大，故本研究選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

圖4 嘌呤紫外吸收光譜圖

2.2 嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

對(duì)一系列梯度稀釋后的嘌呤標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果如圖5所示，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程及相關(guān)系數(shù)如表1所示。結(jié)果顯示，采用2.1最終確定的色譜條件，4種嘌呤能夠很好的分開(kāi)，且在1.0～100.0 mg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，所有組分相關(guān)系數(shù)（R）均高于0.999 0。按3倍信噪比計(jì)算，檢出限為0.010 ～ 0.030 mg·L-1。

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果表

圖5 4種嘌呤混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取濃度為10 mg·L-1的嘌呤混合標(biāo)準(zhǔn)品于3個(gè)進(jìn)樣瓶中，設(shè)置進(jìn)樣次數(shù)為6次，計(jì)算精密度，結(jié)果用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，所測(cè)得的4種嘌呤的RSD均小于0.1%，方法準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好，可用于啤酒樣品中嘌呤的檢測(cè)。

表2 HPLC檢測(cè)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

取嘌呤含量已測(cè)定的3份啤酒樣本，分別補(bǔ)加測(cè)定值0.8、1.0、1.2倍的嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，按照本研究?jī)?yōu)化的色譜參數(shù)條件進(jìn)行測(cè)定，每種倍數(shù)平行3次，計(jì)算平均回收率。回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，4種嘌呤的平均回收率較高，為92%～101%，說(shuō)明利用該方法測(cè)定準(zhǔn)確度好。

表3 4種嘌呤的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表（n=3）

2.5 啤酒樣品中4種嘌呤含量的測(cè)定

根據(jù)2.1所確定的色譜條件測(cè)定啤酒樣品水解后的嘌呤含量，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示所測(cè)10余種市售啤酒中嘌呤含量在50～90 mg·L-1范圍內(nèi)。

圖6 啤酒樣品水解后色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了檢測(cè)啤酒中4種嘌呤類物質(zhì)的高效液相色譜法，優(yōu)化了流動(dòng)相pH和色譜柱柱溫等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了4種嘌呤更好的分離，線性關(guān)系更加優(yōu)良，方法的精密度更好。該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度和精確度均較高，能為啤酒等食品中嘌呤類物質(zhì)的定量測(cè)定提供參考。