謝小來，馬逢春，焦培鑫，扈光輝，陳明明，孫海霞

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030；2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是優(yōu)質(zhì)豆科牧草，營養(yǎng)價值豐富，粗蛋白質(zhì)含量高。苜蓿通常以干草形式被利用，但其收獲、貯存等受天氣及環(huán)境濕度影響較大。青貯作為一種苜蓿貯存處理方式，受天氣等因素影響較少，且適口性好，應(yīng)用前景廣泛。但苜蓿中可溶性碳水化合物含量較低，蛋白質(zhì)含量較高，具有較高緩沖能，青貯過程中粗蛋白質(zhì)降解嚴重[1]。因此，探究出一種提高苜蓿青貯品質(zhì)、防止苜蓿粗蛋白質(zhì)降解、延長苜蓿青貯保存時間的青貯添加劑具有重要意義。單寧酸是一種強極性物質(zhì)，易與蛋白質(zhì)結(jié)合生成絡(luò)合物，具有防腐、殺菌作用[2]。袁英良等研究表明，在苜蓿草粉中添加單寧酸可顯著提高反芻動物小腸消化率，有效保護過瘤胃蛋白[3]。丁學智研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸可抑制瘤胃甲烷產(chǎn)氣量，單寧酸添加濃度越高，抑制程度越好[4]。Avijit等研究發(fā)現(xiàn)，通過飼喂奶牛添加1.5%縮合單寧的孟加拉榕樹葉可顯著提高奶牛乳產(chǎn)量[5]。

目前單寧酸應(yīng)用主要集中在反芻動物日糧，在苜蓿青貯方面研究較少。本試驗通過添加不同水平單寧酸對紫花苜蓿進行青貯，旨在探討單寧酸對紫花苜蓿青貯營養(yǎng)成分、pH、有機酸含量、蛋白質(zhì)降解特性和微生物群落等影響，以篩選青貯效果最佳的單寧酸添加量，為單寧酸在紫花苜蓿青貯的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫花苜蓿，取自中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所種植基地（東經(jīng)126°82′，北緯45°87′），于2020年10月11日9:00時 刈割。原料DM、CP、NDF和ADF含量分別為36.02%、24.36%、30.70%和18.44%（DM）。

單寧酸（Tannic acid），C76H52O46，為進口產(chǎn)品，純度≥75%，粗纖維≤2%，粗灰分≤2%，水分≤6%，可溶性糖≤15%。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，按苜蓿干物質(zhì)計，添加單寧酸水平為0、0.2、0.4和0.6 g·kg-1（單寧酸按商品質(zhì)量計）即TA0、TA1、TA2、TA3，其中TA0為對照組，共4個處理，每個處理均設(shè)置3個重復(fù)，分別于15、30、40和60 d取樣分析。

1.3 青貯制備

將苜蓿晾曬至水分60%，切碎至1~2 cm備用，將苜蓿平均分為4組，將單寧酸按照試驗設(shè)計水平溶解于蒸餾水，均勻噴灑于苜蓿，對照組噴灑等量蒸餾水，均勻混合后使用真空青貯發(fā)酵袋（35 cm×25 cm）裝入500 g原料，共4個處理。使用青貯真空包裝機密封處理，室溫（20~25℃）避光貯藏，于青貯后15、30、45和60 d取樣，每次取3袋，采取隨機開袋取樣方式。

1.4 試驗動物

選擇3頭健康狀況良好、年齡均4歲、體重（550±50）kg、裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛（干奶期）。每日07:00和18:00飼喂，自由飲水。試驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet（DM basis） (%)

1.5 瘤胃體外產(chǎn)氣量試驗

選各組處理45 d苜蓿青貯樣品，試驗根據(jù)Menke等步驟操作[6]。準確稱取5.00 g飼料組合樣品（DM基礎(chǔ)）裝入纖維袋中（42 mm×53 mm；孔徑38~45 μm），置于發(fā)酵管（100 mL玻璃注射器）底部。分別在3頭瘺管奶牛不同瘤胃位點中取出瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾后裝入39℃預(yù)熱好并充入CO2保溫瓶中，配制參照Fievez等[7]，瘤胃液：人工唾液按1：2比例混合后制成人工瘤胃液，使用發(fā)酵管準確吸取30 mL人工瘤胃液，排去發(fā)酵管中氣體，將發(fā)酵管底部膠塞密封，置于39℃水浴搖床中恒溫培養(yǎng)48 h，分別在3、6、12、24和48 h時準確記錄發(fā)酵管刻度示數(shù)，比較不同單寧酸添加水平瘤胃體外產(chǎn)氣量。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 營養(yǎng)指標測定

苜蓿青貯中營養(yǎng)指標參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[8]測定。干物質(zhì)（DM）采用烘干法測定；粗蛋白質(zhì)（CP）采用凱氏定氮法測定；中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）采用ANKOM濾袋技術(shù)并通過酸堿處理法測定。

1.6.2 pH及有機酸測定

苜蓿青貯pH及有機酸參照國標法DB15/T 1458-2018測定。使用pH計測定青貯濾液pH；使用液相色譜法（Agilent 1260 Pre高效液相色譜儀）測定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PrA）、丁酸（BA）含量，色譜柱為Agilent Inc.C18柱（4.6×250 mm，5 μm）。

1.6.3 氮組分測定

粗蛋白質(zhì)（CP）采用凱氏定氮法測定；非蛋白氮（NPN）采用三氯乙酸沉降法測定；氨態(tài)氮（NH3-N）采用苯酚－次氯酸鈉比色法測定；游離氨基酸態(tài)氮（FAA-N）采用茚三酮硫酸肼比色法測定；肽氮（Peptide-N）含量通過計算得出，計算方法為：

肽氮（Pep-N）=非蛋白氮（NPN）-氨態(tài)氮（NH3-N）-游離氨基酸態(tài)氮（FAA-N）。

1.6.4 微生物菌群測定

選用取樣時間0、15、30和45 d各處理組，使用TIANamp Soil DNA Kit試劑盒提取DNA，利用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，確定OD260/OD280為1.7~1.9。通過實時熒光定量PCR技術(shù)測定微生物菌群，針對細菌16S rRNA基因V3~V4區(qū)域作聚合酶鏈反應(yīng)擴增，擴增長度468 bp，使用引物341F（5'ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3'）和806R（5'GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3'）擴 增 細 菌16S rRNA基因V3~V4區(qū)，反應(yīng)體系（50 μL）為：5×PS GXL Buffer 10 μL，Input DNA 2 μL，P5 1 μL，P7 1 μL，Prime STAR GXL 1 μL，dNTP MIX 4 μL，H2O 31 μL；擴增參數(shù)為：預(yù)變性95℃3 min，變性95℃45 s，退火47℃45 s，延伸72℃45 s，35個循環(huán)，延伸72℃10 min；文庫采用NGS?dsD?NA HS檢測試劑盒，使用Qubit?3.0熒光儀進行定量。最后在illumina Hiseq平臺250 bp模式對文庫進行測序。

1.6.5 瘤胃體外產(chǎn)氣量測定

產(chǎn)氣量計算公式為：

式中，Gpt為樣品在t時刻產(chǎn)氣量（mL）；Vt為樣品發(fā)酵t小時后培養(yǎng)管刻度；V0為樣品開始培養(yǎng)時，空白培養(yǎng)管刻度讀數(shù)；W為樣品干物質(zhì)重量（mg）。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件記錄整理，SPSS 26.0軟件統(tǒng)計，one-way ANOVA analysis作方差分析，并用Duncan's方法對各組平均數(shù)多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響

由表2可知，TA1、TA2、TA3組DM含量在不同取樣時間內(nèi)均顯著高于TA0組（P<0.05），取樣時間為15和60 d時，TA1、TA2、TA3組DM含量差異不顯著（P>0.05），取樣時間為30和45 d時，DM含量由高到低依次為TA1>AT2>AT3>TA0，TA1、TA2組差異不顯著（P>0.05）。取樣時間為15 d時，各處理組CP含量差異不顯著（P>0.05）；取樣時間為30、45和60 d時，TA1、TA2、TA3組CP含量顯著高于TA0組（P<0.05）。NDF、ADF含量在各取樣時間內(nèi)差異均不顯著（P>0.05）。

表2 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Effects of different tannic acid additions on nutritional components of alfalfa silage（DM basis） (%)

2.2 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯pH及有機酸的影響

不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯pH及有機酸的影響如表3所示。可知，在取樣時間為15、30、45和60 d時，TA1、TA2、TA3組pH、LA含量顯著低于TA0組（P<0.05），TA3組AA含量顯著低于TA0、TA1、TA2組（P<0.05），隨單寧酸添加量增加LA、AA含量顯著降低（P<0.05）。各處理組均未檢測到PrA。TA0組僅在60 d時檢測到少量BA。

表3 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯pH及有機酸的影響Table 3 Effects of different tannic acid additions on alfalfa silage pH and organic acids

2.3 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯氮組分的影響

由圖1可知，隨取樣時間增加，各組NPN、NH3-N、FAA-N含量均上升，Pep-N含量呈先升后降趨勢，單寧酸添加量對NPN、NH3-N、FAA-N、Pep-N含量有顯著影響（P<0.05），同一取樣時間下，各組NPN、NH3-N、FAA-N含量隨單寧酸添加量升高而顯著降低（P<0.05），Pep-N含量隨單寧酸添加量升高顯著升高（P<0.05）。

圖1 不同單寧酸添加量下紫花苜蓿青貯氮組分含量的變化Fig.1 Changes of nitrogen components in alfalfa silage with different addition of tannic acid

2.4 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯微生物群落的影響

如圖2所示，各組在不同發(fā)酵階段，主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）和放線菌門（Actinobacteriota）共同構(gòu)成，其中變形菌門在各組所有取樣時間內(nèi)相對豐度范圍為97.78%~34.20%，相對豐度隨取樣時間增加而下降，相同處理時間，變形菌門相對豐度隨單寧酸添加量升高而上升；厚壁菌門占所有細菌的1.08%~62.70%，相對豐度隨取樣時間增加而上升，成為厭氧環(huán)境下主要優(yōu)勢微生物，相同處理時間下，厚壁菌門相對豐度隨單寧酸添加量升高而降低；擬桿菌門和放線菌門的相對豐度均小于2%。

圖2 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯門水平細菌的影響Fig.2 Effects of different tannins additions on the level of bacteria in alfalfa silage

2.5 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯瘤胃體外產(chǎn)氣量的影響

由圖3可知，隨發(fā)酵時間延長，各組瘤胃體外產(chǎn)氣量逐漸升高。發(fā)酵時間為3 h時，各處理組瘤胃體外產(chǎn)氣量由高到低依次為TA1>TA2>TA0>TA3，TA1組瘤胃體外產(chǎn)氣量顯著高于其他處理組（P<0.05）；發(fā)酵時間為6、12和24 h時，各處理組瘤胃體外產(chǎn)氣量為TA1>TA0>TA2>TA3，且TA0和TA1組瘤胃體外產(chǎn)氣量差異不顯著（P>0.05），且此時TA0和TA1組瘤胃體外產(chǎn)氣量均顯著高于TA3組（P<0.05）在發(fā)酵時間為48 h時，各處理組瘤胃體外產(chǎn)氣量為TA3>TA2>TA1>TA0，且TA3瘤胃體外產(chǎn)氣量顯著高于TA0、TA1和TA2組（P<0.05）。

圖3 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯45 d體外產(chǎn)氣量的影響Fig.3 Effects of different tannins additions on gas production of alfalfa silage for 45 days

3 討論

3.1 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響

飼料營養(yǎng)水平是衡量苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)重要因素。Tabacco等在紫花苜蓿中添加板栗單寧酸進行青貯，添加量分別為0.65、1.3、1.95 g·kg-1（DM），分別青貯20、40、60、80、100和120 d后取樣分析，研究表明在紫花苜蓿中添加板栗單寧酸可顯著降低DM損失，其中添加量為1.95 g·kg-1時，DM含量增加[9]。Syahniar等利用1.88 g·kg-1（DM）板栗單寧酸添加至木薯葉中進行青貯，結(jié)果表明在青貯28 d后，CP含量高于對照組，且處理組較青貯前CP含量無顯著變化[10]。Nascimento等利用添加量為0、25、50、75 g·kg-1（DM）濃縮單寧酸對紫花苜蓿進行青貯，試驗發(fā)現(xiàn)單寧酸對紫花苜蓿NDF和ADF含量無顯著影響[11]。趙夢迪等添加濃度為0.2%、0.4%、0.6%低水平縮合單寧酸對野火球進行青貯，結(jié)果表明不同濃度單寧酸對青貯的NDF和ADF含量影響不顯著[12]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)添加單寧酸可顯著降低紫花苜蓿青貯的DM、CP含量損失，對NDF、ADF含量影響不顯著，與以上研究結(jié)果一致。原因可能是單寧酸抑制苜蓿青貯中霉菌、梭菌等致腐菌產(chǎn)生，降低飼料中營養(yǎng)消耗利用及DM損失，而單寧酸與蛋白質(zhì)絡(luò)合，防止粗蛋白質(zhì)發(fā)生降解。

3.2 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯pH及有機酸的影響

苜蓿青貯中pH可反映飼料在青貯過程中發(fā)酵品質(zhì)。本試驗中，添加單寧酸可顯著降低青貯pH，在添加0.4 g·kg-1單寧酸時，pH隨青貯時間增加由4.09降低至3.71，顯著低于對照組，這與單寧酸添加至象草研究結(jié)果一致[13]。有機酸含量和種類是衡量苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)一項重要指標，其中LA、AA和BA在青貯發(fā)酵過程中發(fā)揮重要作用，高濃度AA和BA對苜蓿青貯品質(zhì)產(chǎn)生影響，引起苜蓿青貯變質(zhì)[14]。本研究中添加單寧酸會顯著降低LA、AA含量，與李旭嬌研究結(jié)果一致[15]。原因可能是單寧酸具有抑制苜蓿青貯中微生物氧化磷酸化作用，影響產(chǎn)生LA和AA的微生物正常代謝活動及其活性，單寧酸添加量越高，抑制微生物生長效果越強。本試驗中添加單寧酸，LA含量呈下降趨勢，pH顯著降低，Adesogan等在豌豆小麥混貯中添加16 g·kg-1（DM）單寧酸進行青貯，青貯發(fā)酵112 d后，處理組pH和LA含量均顯著低于對照組[16]；楊冬梅等在葛藤中添加濃度為3%、4%單寧酸進行青貯，青貯60 d后，pH、LA含量均隨單寧酸濃度升高而降低[17]，以上研究與本試驗結(jié)果一致。原因可能是單寧酸原料呈酸性，可迅速降低紫花苜蓿青貯pH，添加單寧酸可提升紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，改變青貯飼料中LA與發(fā)酵品質(zhì)之間的變化趨勢。單寧酸作為微生物抑制劑，抑制乳酸菌生長繁殖。Parente研究表明，pH較低的條件下，高濃度LA會對乳酸菌活性起到抑制作用，影響青貯發(fā)酵品質(zhì)，因此在紫花苜蓿發(fā)酵過程中應(yīng)保持適當LA含量以保持青貯品質(zhì)[18]。本試驗中各處理組在青貯發(fā)酵15、30、45和60 d時，樣品均呈綠色，質(zhì)地較好，呈酸香氣味，無霉變現(xiàn)象；對照組在青貯發(fā)酵60 d時，部分莖葉出現(xiàn)少許霉變。BA對青貯品質(zhì)產(chǎn)生不利影響，品質(zhì)優(yōu)良的苜蓿青貯中，BA含量應(yīng)小于0.1%[19]。本試驗中添加單寧酸處理組均未檢測到BA，對照組在發(fā)酵60 d檢測到少量BA，說明在青貯過程中單寧酸抑制丁酸梭菌繁殖，提高紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。

3.3 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯氮組分的影響

蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致苜蓿青貯中NPN含量升高，NPN生成影響家畜對氮的利用率，構(gòu)成NPN的NH3-N、FAA-N、Pep-N等均影響反芻動物對飼料蛋白質(zhì)的吸收。本試驗中，發(fā)酵前期NPN生成速度最快，發(fā)酵后期生成速度趨于平穩(wěn)，表示苜蓿青貯的蛋白質(zhì)降解一般發(fā)生在青貯前期。原因可能是因在發(fā)酵初期植物蛋白酶活性較高，大量植物蛋白酶將飼料中蛋白質(zhì)快速降解，當青貯時間增加，飼料中氧氣含量減少，植物蛋白酶活性降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象減慢[20]。本試驗中添加單寧酸可抑制NPN升高，且添加量越高，抑制效果越好，Albrecht等利用濃度分別為0~27 g·kg-1（DM）單寧酸與紫花苜蓿、紅三葉草、胡枝子等12種基因型豆科牧草進行青貯，青貯35 d取樣分析，研究發(fā)現(xiàn)添加單寧酸可顯著抑制豆科牧草非蛋白氮生成，與本試驗結(jié)果一致[2]?？赡苁怯捎趩螌幩峋哂薪Y(jié)合蛋白質(zhì)的作用，pH較低時，單寧酸易與蛋白質(zhì)結(jié)合生成絡(luò)合物，抑制蛋白質(zhì)降解[21]。大量NH3-N生成影響青貯品質(zhì)，本試驗中，添加單寧酸有效抑制NH3-N產(chǎn)生，添加量越高效果越好，可能是因單寧酸會影響游離氨基酸脫氨基，降低游離氨基酸轉(zhuǎn)化作用，抑制NH3-N產(chǎn)生。Pep-N相較于FAA-N更有利于被反芻動物吸收利用[22]，本試驗中，單寧酸可以抑制飼料中FAA-N產(chǎn)生，同時可以有效保護Pep-N，防止Pep-N在青貯過程中被降解，且添加量高的單寧酸對Pep-N保護作用更強，與李旭嬌研究結(jié)果一致[15]。原因可能是單寧酸可以與Pep-N相結(jié)合，避免在青貯過程中產(chǎn)生降解現(xiàn)象，同時制植物蛋白酶降解作用，抑制FAA-N產(chǎn)生。

3.4 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯微生物群落的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿青貯中變形菌門和厚壁菌門相對豐度最高，表示這兩種菌門在紫花苜蓿青貯過程中具有重要作用，與盧強等研究結(jié)果一致[23]。壁菌門包括促進青貯發(fā)酵的乳酸菌等，是青貯中優(yōu)勢群落，與變形菌門共同組成苜蓿青貯中主要菌群[24]。隨青貯時間延長，厚壁菌門占比逐漸升高[25]。厚壁菌門中主要包括產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群，多種芽孢桿菌可以降解纖維素、蛋白質(zhì)和碳水化合物等大分子化合物。本試驗中，單寧酸抑制NDF、ADF和CP降解，原因可能是因單寧酸添加量越高，厚壁菌門相對豐度降低。變形菌門是革蘭性陰性菌，在青貯過程中易與乳酸菌產(chǎn)生競爭，發(fā)酵利用底物淀粉等有機物[26]，本試驗中變形菌門含量隨單寧酸添加量升高而升高，可能是導(dǎo)致在青貯過程中LA含量降低的原因。因此，將單寧酸作為紫花苜蓿青貯添加劑時應(yīng)注意控制添加量。

3.5 不同單寧酸添加量對紫花苜蓿青貯瘤胃體外產(chǎn)氣量的影響

飼料瘤胃體外產(chǎn)氣量可反映營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解程度，產(chǎn)氣量越多，表示瘤胃內(nèi)發(fā)酵活動越強。本試驗中，隨發(fā)酵時間增加，各組青貯瘤胃體外產(chǎn)氣量均隨之升高，體外發(fā)酵3~24 h時，添加0.4、0.6 g·kg-1單寧酸處理組紫花苜蓿青貯瘤胃體外產(chǎn)氣量均低于對照組，與王敬堯[27]、Geerkns等[28]結(jié)果一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因有兩方面：一是高水平單寧酸會改變反芻動物瘤胃內(nèi)碳水化合物的發(fā)酵類型；二是因為單寧酸可影響苜蓿青貯微生物活性，使苜蓿青貯不易被微生物降解。本試驗中，當體外發(fā)酵24~48 h時，添加0.2、0.4、0.6 g·kg-1單寧酸處理組體外瘤胃產(chǎn)氣量均高于對照組。包熙旺等利用單寧含量較高香蕉莖葉體外發(fā)酵，探究香蕉莖葉中單寧對瘤胃體外產(chǎn)氣量的影響，研究發(fā)現(xiàn)體外產(chǎn)氣量在發(fā)酵初期產(chǎn)氣量顯著低于對照組，當體外發(fā)酵到8~48 h時，產(chǎn)氣量迅速增加，與本試驗結(jié)果一致[29]，表明單寧酸在短時間內(nèi)影響瘤胃消化吸收速度，但隨消化時間增加，單寧酸微生物抑制作用減弱，原因可能是單寧酸在瘤胃發(fā)酵后期可被瘤胃微生物降解，導(dǎo)致瘤胃消化率升高，產(chǎn)氣量增加。

4 結(jié)論

紫花苜蓿青貯中添加單寧酸可有效保持干物質(zhì)含量，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，顯著降低粗蛋白質(zhì)降解，改變紫花苜蓿青貯微生物群落組成，提高48 h瘤胃體外產(chǎn)氣量。添加量為0.4 g·kg-1時，厚壁菌門相對豐度較高，青貯45 d后獲得穩(wěn)定品質(zhì)。