張汝倩，洪恩宇，于永波，任慧敏，耿迪，楊慧，王雅頔，周萍萍，魯潔，郭永麗

作者單位：100045 北京，國家兒童醫(yī)學(xué)中心（北京）首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京市兒科研究所兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點(diǎn)實驗室（張汝倩、洪恩宇、于永波、任慧敏、耿迪、楊慧、王雅頔、周萍萍、魯潔、郭永麗）；兒童臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫（洪恩宇、于永波、任慧敏、耿迪、楊慧、王雅頔、周萍萍、魯潔、郭永麗）

RNA 在人類多種生理和病理過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。近些年來，隨著分子生物技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的廣泛應(yīng)用，以 RNA 為靶標(biāo)進(jìn)行的組織及細(xì)胞的分子生物學(xué)研究較為廣泛。在 RNA 的科學(xué)研究中，高質(zhì)量 RNA可滿足 RT-PCR、Northern blot、基因表達(dá)譜、轉(zhuǎn)錄組測序和陣列分析等生物學(xué)實驗的研究需求[1-2]，所以能夠獲得具有生物活性及化學(xué)穩(wěn)定的完整 RNA 分子至關(guān)重要。然而由于 RNA 自身結(jié)構(gòu)特性[3]和環(huán)境中廣泛分布的核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）[4]，從血液、組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中抽提得到的 RNA 的穩(wěn)定保存相對困難。

目前，有關(guān) RNA 濃度和純度的影響因素研究主要集中在提取方法、樣本類型、儲存溫度和時間等方面，有文獻(xiàn)報道不同的放置時間和溫度會影響 RNA 提取的質(zhì)量濃度，但保存時間對 RNA 的純度影響各報道結(jié)論不統(tǒng)一[5-6]。根據(jù)臨床檢測和科研的需要，提取后 RNA 保存條件和時間對RNA 濃度和純度的影響也同樣非常重要。同時，我們查詢文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)提取后 RNA 的保存溫度和放置時間對 RNA 的質(zhì)量影響也有所不同[7-8]，不同濃度的 RNA 反復(fù)凍融對其濃度和純度的影響也鮮有報道。所以，本文通過探討不同濃度的 RNA 在 4 ℃ 及常溫條件下放置不同時間，評估其對RNA 濃度和純度的影響；另外，通過反復(fù)凍融不同濃度的RNA，研究不同濃度的 RNA 凍融次數(shù)對其濃度和純度的影響，以期為臨床檢測和科學(xué)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要設(shè)備 4 ℃ 和–80 ℃ 冰箱均為三洋產(chǎn)品；300 servies AE 生物安全柜和 NanoDrop 分光光度計均購自美國 Thermo 公司；1 L 便攜式液氮罐、高速冷凍離心機(jī)均購自德國 Eppendorf 公司；OSE-Y10 電動組織研磨器購自美國 Qiangen 公司。

1.1.2 主要試劑 AllPrep DNA/RNA Mini Kit 購自美國Qiangen 公司；β-巰基乙醇等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與總 RNA 提取

1.2.1.1 組織標(biāo)本的留取 組織標(biāo)本為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院手術(shù)切除的患兒組織樣本（神經(jīng)母細(xì)胞瘤瘤體）3 例，在組織離體 30 min 內(nèi)，采集組織標(biāo)本大小約30 mg/份（共 5 份），并迅速置于液氮中保存，以上操作均為無菌操作，并已獲取相關(guān)知情同意書。

1.2.1.2 總 RNA 提取 組織樣本 RNA 的提取嚴(yán)格按照操作說明書操作，步驟如下：每 30 mg 組織樣本加入0.6 ml 緩沖液 RLT 和 β-巰基乙醇混合液，組織研磨器破碎后離心，吸取上層勻漿至帶有收集管的過濾柱中，離心，加入等體積 70% 乙醇，離心，再加入緩沖液 RW1、緩沖液 RPE 去除蛋白及殘留乙醇，最后加 50 μl RNasefree water 溶解 RNA。

1.2.2 樣本分組 ①不同濃度 RNA 4 ℃ 放置組：組織樣本提取 RNA 后混勻稀釋成濃度 C1（400 ng/μl）、C2（200 ng/μl）、C3（100 ng/μl）和 C4（50 ng/μl）分裝于 RNase free 凍存管中并編號，4 ℃ 放置 0、6、12、24、48、72、96 及 168 h，行 RNA 濃度及純度檢測，每組 3 個重復(fù)樣本。②不同濃度 RNA 常溫放置組：組織樣本提取 RNA后混勻稀釋成濃度 C1（400 ng/μl）、C2（200 ng/μl）、C3（100 ng/μl）和 C4（50 ng/μl）分裝于 RNase free 凍存管中并編號，常溫放置 0、3、6、12、24、48、72、96 及 168 h，行 RNA 濃度及純度檢測，每組 3 個重復(fù)樣本。③不同濃度 RNA 反復(fù)凍融組：組織樣本提取 RNA 后混勻稀釋成濃度 C1（400 ng/μl）、C2（200 ng/μl）、C3（100 ng/μl）和C4（50 ng/μl）分裝于 RNase free 凍存管中并編號，–80 ℃冰箱保存，每組 3 個重復(fù)樣本。將 RNA樣本每天凍融2 次，上下午各一次，待 RNA 完全融化后放回–80 ℃ 保存，重復(fù)此操作，樣本共計凍融 5 次（N5）、10 次（N10）、15 次（N15）及 20 次（N20），并在 2 周內(nèi)行 RNA 濃度及純度檢測。

1.2.3 RNA 濃度和純度檢測 取 2 μl RNA樣本，使用核酸蛋白檢測儀 NanoDrop 檢測 RNA 濃度及OD260/OD280比值。比值在 1.8～2.1 范圍內(nèi)，表明 RNA 純度較好；比值 <1.8 表明有 DNA、蛋白質(zhì)污染；比值 >2.1 表明 RNA降解或有異硫氰酸胍等物質(zhì)污染。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，設(shè)定P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度 RNA 在 4 ℃ 放置不同時間對 RNA 質(zhì)量的影響

使用 NanoDrop 分光光度計檢測 RNA 的濃度和純度。結(jié)果如表 1所示，不同濃度 RNA 在 4 ℃ 放置不同時間 RNA 濃度范圍：C1（400 ng/μl：399.0～436.4 ng/μl）；C2（200 ng/μl：205.5～215.1 ng/μl）、C3（100 ng/μl：101.5～106.8 ng/μl）和 C4（50 ng/μl：48.6～53.1 ng/μl）。隨著放置時間的延長，不同濃度的 RNA樣本在 24 h 時均出現(xiàn)下降趨勢，48 h 時均出現(xiàn)上升趨勢，72 h 后低濃度的 RNA（50 ng/μl）出現(xiàn)下降趨勢，但各時間組并無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；不同濃度 RNA 4 ℃ 放置不同時間 RNA 純度OD260/OD280比值范圍：C1（400 ng/μl：2.03～2.05）；C2（200 ng/μl：2.02～2.04）、C3（100 ng/μl：2.00～2.02）和C4（50 ng/μl：1.99～2.05），各組標(biāo)準(zhǔn)差在 ±0.01～±0.58 之間，且無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果表明，組織樣本RNA 在 4 ℃ 條件下放置，不同濃度的 RNA樣本其濃度整體呈先下降后上升的趨勢，RNA 純度基本保持不變。

表1 不同濃度 RNA樣本在 4 ℃ 放置不同時間對 RNA 濃度和純度的影響（±s）

表1 不同濃度 RNA樣本在 4 ℃ 放置不同時間對 RNA 濃度和純度的影響（±s）

C1（400 ng/μl） C2（200 ng/μl） C3（100 ng/μl） C4（50 ng/μl）放置時間（h） 濃度（ng/μl） OD260/OD280 濃度（ng/μl） OD260/OD280濃度（ng/μl） OD260/OD280 濃度（ng/μl） OD260/OD280 0 417.4 ± 7.26 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.36 2.02 ± 0.01103.2 ± 0.46 2.01 ± 0.01 52.8 ± 8.18 1.99 ± 0.03 6 417.2 ± 15.59 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.36 2.02 ± 0.01103.2 ± 0.46 2.01 ± 0.01 51.4 ± 1.69 1.99 ± 0.04 12 407.1 ± 4.91 2.05 ± 0.01 206.0 ± 3.89 2.03 ± 0.02103.0 ± 2.38 2.01 ± 0.03 51.0 ± 1.99 1.99 ± 0.03 24 399.0 ± 6.33 2.04 ± 0.01 207.4 ± 3.42 2.04 ± 0.01102.6 ± 1.78 2.00 ± 0.03 50.5 ± 1.19 1.99 ± 0.03 48 424.2 ± 14.92 2.05 ± 0.01 205.5 ± 0.87 2.03 ± 0.01101.5 ± 1.15 2.01 ± 0.01 53.1 ± 3.16 2.00 ± 0.02 72 426.6 ± 17.21 2.04 ± 0.01 215.1 ± 6.60 2.03 ± 0.01106.4 ± 3.87 2.01 ± 0.00 51.8 ± 2.55 2.01 ± 0.01 96 433.7 ± 15.01 2.03 ± 0.01 211.2 ± 3.48 2.04 ± 0.01105.5 ± 1.44 2.02 ± 0.01 51.3 ± 1.44 2.02 ± 0.01 168 436.4 ± 8.71 2.04 ± 0.02 214.7 ± 4.65 2.03 ± 0.01106.8 ± 1.25 2.01 ± 0.02 48.6 ± 0.51 2.05 ± 0.58

2.2 不同濃度 RNA樣本常溫放置不同時間對 RNA 濃度和純度的影響

結(jié)果如表 2所示，不同濃度 RNA 常溫放置不同時間RNA 濃度范圍：C1（400 ng/μl：404.7～417.4 ng/μl）；C2（200 ng/μl：205.7～218.2 ng/μl）、C3（100 ng/μl：102.1～108.5 ng/μl）和 C4（50 ng/μl：49.0～53.6 ng/μl）。隨著放置時間的延長，不同濃度的 RNA樣本在 6 h 時均出現(xiàn)下降趨勢，其他時間濃度呈無規(guī)律變化，各時間組也無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；不同濃度 RNA 常溫放置不同時間純度OD260/OD280比值范圍：C1（400 ng/μl：2.04～2.06）；C2（200 ng/μl：1.98～2.05）、C3（100 ng/μl：1.93～2.03）和 C4（50 ng/μl：1.93～2.05），各組標(biāo)準(zhǔn)差在 ±0.01～±0.04 之間，且無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果表明，組織樣本 RNA在常溫條件下放置，不同濃度的 RNA樣本在 6 h 時均出現(xiàn)下降趨勢，其他時間濃度呈無規(guī)律變化，RNA 的純度基本保持不變。

表2 不同濃度 RNA樣本常溫放置不同時間對 RNA 濃度和純度的影響（±s）

表2 不同濃度 RNA樣本常溫放置不同時間對 RNA 濃度和純度的影響（±s）

C1（400 ng/μl） C2（200 ng/μl） C3（100 ng/μl） C4（50 ng/μl）放置時間（h） 濃度（ng/μl） OD260/OD280 濃度（ng/μl） OD260/OD280濃度（ng/μl） OD260/OD280 濃度（ng/μl） OD260/OD280 0 417.4 ± 7.26 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.36 2.02 ± 0.01103.2 ± 0.46 2.01 ± 0.01 52.8 ± 8.18 1.99 ± 0.03 3 412.4 ± 20.50 2.05 ± 0.00 207.7 ± 2.98 2.04 ± 0.01104.4 ± 2.47 2.01 ± 0.01 51.0 ± 1.08 2.00 ± 0.04 6 404.7 ± 3.15 2.05 ± 0.01 205.7 ± 2.05 2.04 ± 0.01102.1 ± 2.69 2.01 ± 0.02 50.3 ± 1.43 2.01 ± 0.04 12 404.7 ± 5.55 2.06 ± 0.01 207.3 ± 1.31 2.05 ± 0.01104.1 ± 2.21 2.03 ± 0.02 50.8 ± 1.19 2.03 ± 0.02 24 406.3 ± 4.28 2.06 ± 0.01 206.2 ± 3.12 2.05 ± 0.01104.4 ± 1.37 2.03 ± 0.01 50.4 ± 1.71 2.03 ± 0.02 48 409.6 ± 5.55 2.05 ± 0.00 205.7 ± 2.02 2.04 ± 0.02103.5 ± 3.44 2.03 ± 0.01 50.8 ± 0.70 2.02 ± 0.02 72 414.2 ± 5.06 2.05 ± 0.01 207.3 ± 3.97 2.04 ± 0.01105.4 ± 2.55 2.02 ± 0.02 49.9 ± 1.20 2.05 ± 0.03 96 412.4 ± 3.22 2.05 ± 0.00 207.0 ± 2.30 2.04 ± 0.01102.4 ± 1.40 2.01 ± 0.02 49.0 ± 1.20 2.03 ± 0.01 168 411.1 ± 43.73 2.04 ± 0.02 218.2 ± 18.711.98 ± 0.03108.5 ± 2.18 1.93 ± 0.02 53.6 ± 2.44 1.93 ± 0.02

2.3 組織 RNA樣本冰上反復(fù)凍融對不同濃度 RNA 質(zhì)量的影響

結(jié)果如表 3所示，不同濃度的 RNA樣本經(jīng)反復(fù)凍融5、10、15 和 20 次（2 周內(nèi)）后 RNA 濃度范圍：C1（400 ng/μl：377.8～417.4 ng/μl）；C2（200 ng/μl：195.0～209.8 ng/μl）、C3（100 ng/μl：97.0～103.2 ng/μl）和 C4（50 ng/μl：48.0～52.8 ng/μl）。隨著凍融次數(shù)增多，不同濃度的 RNA樣本濃度均出現(xiàn)明顯下降趨勢，但各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；不同濃度 RNA 經(jīng)反復(fù)凍融 5、10、15 和 20 次（2 周內(nèi)）后 RNA 純度OD260/OD280比值范圍：C1（400 ng/μl：2.03～2.04）；C2（200 ng/μl：2.02～2.03）、C3（100 ng/μl：1.99～2.01）和 C4（50 ng/μl：1.99～2.00），各組標(biāo)準(zhǔn)差在 ±0.01～±0.03 之間，且無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。以上結(jié)果表明，保存在–80 ℃ 冰箱中不同濃度的RNA樣本，在冰上反復(fù)凍融（2 周內(nèi)）后濃度均有下降，RNA 的純度基本保持不變。

表3 組織 RNA樣本冰上反復(fù)凍融對 RNA 濃度和純度的影響（±s）

表3 組織 RNA樣本冰上反復(fù)凍融對 RNA 濃度和純度的影響（±s）

C1（400 ng/μl） C2（200 ng/μl） C3（100 ng/μl） C4（50 ng/μl）凍融次數(shù)（n） 濃度（ng/μl） OD260/OD280 濃度（ng/μl） OD260/OD280濃度（ng/μl） OD260/OD280 濃度（ng/μl） OD260/OD280 0 417.4 ± 7.3 2.04 ± 0.01 209.8 ± 9.362.02 ± 0.01103.2 ± 0.5 2.01 ± 0.01 52.8 ± 8.2 1.99 ± 0.03 5 396.2 ± 2.3 2.03 ± 0.01 203.8 ± 1.6 2.03 ± 0.01102.0 ± 4.5 2.00 ± 0.01 49.4 ± 1.1 2.00 ± 0.03 10 395.1 ± 8.4 2.04 ± 0.01 199.0 ± 4.6 2.03 ± 0.01100.3 ± 1.2 2.00 ± 0.01 49.6 ± 1.0 2.00 ± 0.01 15 392.0 ± 4.4 2.04 ± 0.01 197.3 ± 3.0 2.02 ± 0.0197.9 ± 1.9 1.99 ± 0.02 48.0 ± 1.5 1.99 ± 0.02 20 377.8 ± 13.9 2.04 ± 0.01 195.0 ± 6.9 2.02 ± 0.0197.0 ± 2.2 2.00 ± 0.02 48.3 ± 1.8 1.99 ± 0.01

3 討論

RNA樣本的質(zhì)量檢測包括濃度、純度、完整性以及RT-PCR 反應(yīng)擴(kuò)增率等，而完整性和均一性是評價 RNA 質(zhì)量的兩個最關(guān)鍵指標(biāo)[9-12]。生物分析儀和OD260/OD280的比值是反映 RNA 質(zhì)量的常用方法和指標(biāo)。由于 RNA 極其容易降解，影響其質(zhì)量的因素眾多，目前的科學(xué)研究中大多都集中在不同標(biāo)本的保存條件和時間對 RNA 質(zhì)量的影響，如何松哲等[5]研究的是不同保存和處理方式對全血標(biāo)本總RNA 提取的影響；李維凱等[13]研究的是保存條件對大鼠海馬組織總 RNA 質(zhì)量的影響；張杰等[6]研究的是乳腺癌細(xì)胞在不同溫度和不同放置時間對總 RNA 提取濃度和純度的影響等；然而不同濃度的 RNA 在不同的保存條件下對RNA 的質(zhì)量影響卻少有報道。

楊秀榮等[8]報道過將 RNA樣本置于 4 ℃ 條件下，每隔 5 h、10 h、15 h、20 h、25 h、3 d、7 d 和 14 d 對提取的 RNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示 14 d 后 RNA 完整性較好。我們研究同樣發(fā)現(xiàn)不同濃度的 RNA樣本在 4 ℃ 條件下放置 168 h（1 周），RNA 濃度和純度均與 0 h 沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明該條件下不會影響 RNA 的濃度和純度。毛君婷等[7]報道過將 RNA樣本置于 4 ℃ 條件下放置 24 h 和48 h，結(jié)果顯示樣本在室溫條件下可以保存 24 h 以上，48 h時有少量降解，我們研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的 RNA樣本在常溫條件下放置 168 h（1 周），RNA 濃度和純度均與 0 h 沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明該條件下不會影響 RNA 的濃度和純度。因此不同濃度的 RNA樣本在 4 ℃ 或常溫放置 168 h（1 周）內(nèi)，雖然 RNA 濃度有降低和升高，但是 RNA 純度OD260/OD280比值基本保持不變。導(dǎo)致 RNA 純度改變的原因我們認(rèn)為是 RNA 不穩(wěn)定，在存放過程中核酸降解一方面可以影響其濃度，另一方面降解產(chǎn)物可影響 RNA 純度，最終會影響 RNA 的質(zhì)量。我們發(fā)現(xiàn)以O(shè)D260/OD280比值作為評價指標(biāo)，RNA 在 4 ℃ 或常溫條件下放置 1 周RNA 純度基本不變。即使如此，由于生物分析儀是分析和反映 RNA 質(zhì)量的另一常用方法和指標(biāo)，但是我們忽略了該方法對研究結(jié)果進(jìn)一步驗證，這是我們研究存在的局限性。

RNA 通常是從組織、全血和培養(yǎng)的細(xì)胞中獲得[14]，從不同的標(biāo)本中提取的 RNA 濃度會有所不同，在我們實際的臨床檢測和科學(xué)研究過程中，經(jīng)常需要對某一樣品 RNA 進(jìn)行重復(fù)檢測，因此，探討不同濃度的 RNA 反復(fù)凍融對RNA 質(zhì)量的影響具有現(xiàn)實意義。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高濃度的 RNA 凍融 1、11、26 和 41 次，結(jié)果顯示隨著凍融次數(shù)的增多，RNA 濃度出現(xiàn)明顯的下降趨勢，但是各組并沒有統(tǒng)計學(xué)差異[15]。本次研究我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的 RNA凍融多次（5、10、15 和 20 次），RNA 濃度均出現(xiàn)明顯的下降趨勢，但是各組 RNA 濃度和純度并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，相應(yīng)的OD260/OD280均在 1.8～2.1 之間，純度基本保持不變。因此保存在–80 ℃ 冰箱中不同濃度的 RNA 反復(fù)凍融后對 RNA 的濃度有一定影響，但對 RNA 的純度影響不大。

總之，本研究結(jié)果顯示不同濃度的 RNA樣本在 4 ℃或常溫條件下放置 1 周，不會對 RNA 濃度和純度造成明顯影響；不同濃度的 RNA 在 2 周內(nèi)反復(fù)凍融會降低RNA 的濃度，但是不會影響 RNA 的純度。