黃明柳，賴小敏

作者單位：510080 廣州，中山大學中山醫(yī)學院微生物學教研室/熱帶病防治研究教育部重點實驗室/結(jié)核病研究所/海洋微生物功能分子廣東省高校重點實驗室/廣東省重大傳染病預防和控制技術中心

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19 ）由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起[1]。SARS-CoV-2 快速的傳播能力讓醫(yī)務工作者篩查潛伏感染者面臨著巨大壓力。目前主要通過核酸檢測來確診病例，但核酸檢測耗時長，患者病程、標本采集、病毒核酸提取過程都有可能干擾核酸檢測結(jié)果，使核酸檢測結(jié)果出現(xiàn)“假陰性”，易發(fā)生漏診[2-5]。SARS-CoV-2 抗原/抗體檢測方法，在某種程度上更方便快捷，且能彌補核酸檢測漏檢的風險。但市面上 SARS-CoV-2 抗原/抗體檢測試劑盒都存在出現(xiàn)“假陽性”的問題，使其只能作為新型冠狀病毒核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測指標，不能用于一般人群檢測。除了類風濕因子（rheumatoid factors，RF）、嗜異性抗體（heterophilic antibodies，HA）、補體等因素干擾，使抗原/抗體檢測結(jié)果出現(xiàn)“假陽性”外，人冠狀病毒之間的免疫交叉反應也可能是 SARS-CoV-2 抗原/抗體檢測出現(xiàn)“假陽性”的重要原因[6-9]。

能引起人類感染的冠狀病毒有 7 種，即人冠狀病毒 229E （ human coronavirus 229E ，HCoV-229E）、人冠狀病毒 HKU1（HCoV-HKU1）、人冠狀病毒 NL63（HCoV-NL63）、人冠狀病毒OC43（HCoV-OC43）、嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（ severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV），以及此次引起全球大流行的SARS-CoV-2[10]。有分析指出，這 7 種冠狀病毒的棘突蛋白（spike protein，S protein）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N protein）氨基酸序列同源性達 20%～90%，同時也有實驗證明不同種的冠狀病毒 N 蛋白或 S 蛋白存在免疫交叉反應[11-21]。這提示 SARS-CoV-2 抗原/抗體檢測也可能受其他冠狀病毒的影響。目前市面上 SARS-CoV-2 抗體檢測卡上包被的主要是 SARS-CoV-2 S 蛋白、N 蛋白這類完整的大分子蛋白，其因不同種冠狀病毒免疫交叉反應引起的“假陽性”結(jié)果的可能性更高，為了避免這種結(jié)果，需要尋找特異性更高的蛋白多肽來建立 SARS-CoV-2 特異性抗原/抗體檢測試劑盒。

S 蛋白是冠狀病毒誘導產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，廣泛應用于抗體檢測。我們擬針對SARS-CoV-2 的 S 蛋白，基于生物信息學技術設計尋找 SARS-CoV-2 的 S 蛋白區(qū)別于 HCoV-229E、HCoV-HKU1 、 HCoV-NL63 、 HCoV-OC43 、SARS-CoV、MERS-CoV 的 S 蛋白的特異性多肽，通過 ELISA 初步驗證這些特異性多肽，分析討論這些基于生物信息學技術篩選出的特異性多肽在實際應用中是否有意義，為研發(fā)特異性更高的SARS-CoV-2 特異性抗體/抗原快速檢測試劑盒建立基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 普通呼吸系統(tǒng)疾病患者外周血血清21 例，收集自廣州市胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科；11 例COVID-19 抗體陽性患者血清，患者血清經(jīng)微磁力化學發(fā)光檢測新型冠狀病毒 IgG 抗體為陽性?；颊呋蚱浼覍僦橥獠⒑炇鹬橥鈺?。

1.1.2 實驗動物 新西蘭兔 5 只，3月齡，雄性，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心（三水基地）提供，普通級，許可證號 SYXK（粵）2019-0035。

1.1.3 主要試劑與儀器 8 周標準兔多抗制備佐劑為博奧龍公司產(chǎn)品；96 孔酶標板購自香港愛必勝公司；胎牛血清為 Gibco 公司產(chǎn)品；SARS-CoV-2、HCoV-HKU1、MERS-CoV S 蛋白兔多抗為義翹神州公司產(chǎn)品；HCoV-229E、HCoV-NL63、SARS-CoV S 蛋白兔多抗為 Abclonal 公司產(chǎn)品；HCoV-OC43 S 蛋白兔多抗為華美生物公司產(chǎn)品；健康新西蘭兔血清為本實驗室自主保存；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔 IgG抗體、HRP 標記的羊抗人 IgG 抗體為索萊寶公司產(chǎn)品；3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、1 mol/L H2SO4反應終止液為博奧森公司產(chǎn)品；特異性多肽與偶聯(lián)KLH 的特異性多肽由陜西譽邦生物科技有限公司合成（由于多肽序列尚未申請專利，故本文暫不公布）；S6-Linker-S7、SARS-CoV-2 S 蛋白均由本實驗室制備，兩種蛋白經(jīng)純化后，由 BCA 法定量。酶標儀 Sunrise 購自奧地利 Tecan 公司。

1.2 方法

1.2.1 S 蛋白特異性多肽設計方法 用SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 病毒株（ GenBank accession MN908947.3）基因組序列推測出的 S 蛋白氨基酸序列（序列編號 YP_009724390.1）分別與 HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV 的 S 蛋白氨基酸序列運用 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具比對（GenBank 序列編號分別為：NP_073551.1、YP_173238.1、APF29063.1、AIX10763.1、NP_828851.1、YP_009047204.1）。尋找 SARS-CoV-2 S 蛋白不同于其他 6 種病毒 S蛋白的氨基酸序列，縮小 SARS-CoV-2 S 蛋白特異性多肽的找尋范圍。

運用可預測與主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）結(jié)合的抗原表位的 NetMHCpan EL4.0 軟件（http://tools.immuneepitope.org/mhci）預測 SARS-CoV-2 S 蛋白不同于其他 6 種病毒 S 蛋白的特異性序列的潛在抗原表位，以及 HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV的 S 蛋白潛在抗原表位。然后，依據(jù)“抗原肽-MHC”復合物間的親和力（通常，%rank <0.5被定義為強結(jié)合，%rank <2 為弱結(jié)合，其他為不結(jié)合）進行篩選，保留 %rank 在 0～2 的短肽作為候選結(jié)合表位。

應用 BLAST 工具，將 SARS-CoV-2 S 蛋白特異性序列的候選表位與其他 6 種冠狀病毒 S 蛋白的候選表位進行同源比對，在結(jié)果中記錄下所有同源表位的 E-value 和 Identity。根據(jù) E 值（通常當 E 值小于 1E-05 時，表明兩序列有較高的同源性）進行篩選，保留 E 值 <1E-05 的同源表位，分析多肽的特異性。

運用 ProtParam （ https://web.expasy.org/protparam/）軟件預測篩選出的多肽的理化性質(zhì)；ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）軟件分析其疏水性；SOPMA 工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析預測其二級結(jié)構(gòu)及各成分的占比。選擇具有抗原表位，特異性高，親水性好，具有無規(guī)則卷曲的多肽，送往生物技術公司合成。

1.2.2 ELISA 驗證多肽抗原性試驗 將合成好的多肽、S6-Linker-S7 融合蛋白、S 蛋白用碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）稀釋后，分為 S2、S3、S6、S7、S6-Linker-S7、S6 + S7、S2 + S3、S2 + S3+ S6-Linker-S7、S2 + S3 + S6 + S7、S 蛋白陽性對照組，共 10 組，每組設置 6 個復孔，其中 3 個復孔用作實驗組，另外 3 個復孔用于陰性對照。前 9 組稀釋成 5 mg/ml 濃度包被，S 蛋白組按30 μg/ml 濃度包被。以 100 μl/孔包被 96 孔酶標板，于 4 ℃ 放置 16 h。棄去包被液，用含 10% 胎牛血清的封閉液[PBS（0.01 mol/L）配制]，4 ℃ 封閉過夜，棄去封閉液，室溫晾干備用。實驗組每孔加入 100 μl SARS-CoV-2 S 蛋白兔多抗（PBS 配制，稀釋度 1:1000），陰性對照組每孔加入 100 μl健康新西蘭兔血清（稀釋度 1:1000），37 ℃ 孵育1 h，用 PBST（含 0.1% Tween 20 的 PBS）洗滌5 次，拍干，再加入用 HRP 標記的羊抗兔 IgG 抗體（稀釋度 1:3000）100 μl/孔，37 ℃ 反應 1 h，用 PBST 洗滌 5 次，拍干，每孔加入 100 μl TMB顯色液，37 ℃ 顯色 20 min，每孔加入 100 μl 終止液終止反應，于酶標儀 450 nm 處測定OD450nm值。

1.2.3 ELISA 驗證多肽免疫原性試驗 分別將偶聯(lián) KLH 的特異性多肽 S2-KLH、S3-KLH、S6-KLH、S7-KLH、SARS-CoV-2 S 蛋白按照每針 50 μg 的劑量用生理鹽水稀釋成 100 μl 后，與 100 μl 8 周標準兔多抗制備佐劑混合，通過肌肉注射免疫新西蘭兔，每只兔子注射 200 μl。第 21 天和第 42 天按照同樣的方式分別加強免疫一針。第 52 天采血，取免疫血清。

SARS-CoV-2 S 蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋成2 μg/ml，按前面所述的 ELISA 實驗方法，包被、封閉 ELISA 板。以 S2-KLH、S3-KLH、S6-KLH、S7-KLH 制備的免疫兔血清為實驗組，未免疫的健康兔血清為陰性對照，免疫 SARS-CoV-2 S 蛋白的兔血清為陽性對照，以 1:500 的比例稀釋兔血清分別與包被好 SARS-CoV-2 S 蛋白的酶標板反應，檢測反應OD450nm值。

1.2.4 SARS-CoV-2 S 蛋白與 S6-Linker-S7 對比檢測不同人群血清 IgG 抗體 S6-Linker-S7 融合蛋白、SARS-CoV-2 S 蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋成2 μg/ml，按前面所述 ELISA 實驗方法，包被、封閉 ELISA 板。普通呼吸系統(tǒng)疾病患者血清以1:500 的比例稀釋分別與包被好的 S6-Linker-S7融合蛋白、SARS-CoV-2 S 蛋白酶標板反應，二抗加入用 HRP 標記的羊抗人 IgG 抗體（稀釋度1:3000），檢測反應OD450nm值。COVID-19 抗體陽性患者血清經(jīng)過 56 ℃、30 min 滅活后也重復此操作，該操作在廣東省內(nèi)新冠定點醫(yī)院內(nèi)進行。

1.2.5 ELISA 驗證多肽的特異性 將 S6-Linker-S7融合蛋白、SARS-CoV-2 S 蛋白用碳酸鹽緩沖液稀釋成 30 μg/ml，按前面所述 ELISA 實驗方法，包被、封閉 ELISA 板，HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2 S 蛋白兔多抗和健康兔血清，以1:500 的比例稀釋后分別與包被 S6-Linker-S7 融合蛋白、SARS-CoV-2 S 蛋白的酶標板反應，檢測反應OD450nm值。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用統(tǒng)計學處理軟件 SPSS 16.0 進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BLAST 分析結(jié)果

應用 BLAST 工具，分析比對了 SARS-CoV-2 S 蛋白氨基酸序列與不同種冠狀病毒間 S 蛋白氨基酸序列相似性：HCoV-229E（31.07%）、HCoV-HKU1（35.43%）、HCoV-NL63（30.57%）、HCoV-OC43（37.5%）、SARS-CoV（75.96%）、MERS-CoV S（35.1%）。其中與 SARS-CoV-2 S 蛋白氨基酸序列相似性最高的是 SARS-CoV，相似性最低的為 HCoV-NL63 S 蛋白。SARS-CoV-2 與其他冠狀病毒 S 蛋白序列的相似性，表明以SARS-CoV-2 S 蛋白制備抗體/抗原檢測試劑盒很有可能因為免疫交叉反應而出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果。

2.2 SARS-CoV-2 S 蛋白特異性多肽軟件篩選結(jié)果

根據(jù) SARS-CoV-2 S 蛋白氨基酸序列與其他冠狀病毒 S 蛋白氨基酸比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)S2、S3、S6、S7 這 4 條多肽氨基酸序列與其他 6 種冠狀病毒 S 蛋白氨基酸序列相似性最低（因多肽尚未申請專利，故多肽氨基酸序列暫不公布）。

通過“ 抗原肽-MHC” 結(jié)合預測工具NetMHCpan EL4.0 預測，多肽 S2、S3、S6、S7、HCoV-229E 、 HCoV-HKU1 、 HCoV-NL63 、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV 的 S 蛋白得到的預測表位條數(shù)，以及根據(jù) %rank 分值篩選出的 0～2 的能與 MHC 結(jié)合的候選表位條數(shù)，見表 1。

表1 多肽及 6 種人冠狀病毒 S 蛋白的預測表位與候選表位條數(shù)Table 1 The number of predicted epitopes and candidate epitopes of polypeptides and six human coronavirus S proteins

多肽 S2、S3、S6、S7 的候選抗原表位與HCoV-229E 、 HCoV-HKU1 、 HCoV-NL63 、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV S 蛋白的候選表位進行同源比對，其同源表位條數(shù)，見表 2。根據(jù) E 值 <1E-05 的標準篩選同源表位，多肽S2、S3、S6、S7 抗原表位與 HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV、HCoV-NL63 S 蛋白抗原表位同源比對 E 值均大于 1E-05，同源結(jié)果不可靠。多肽 S2、S3、S6、S7 與 SARS-CoV S 蛋白抗原表位同源比對，E 值 <1E-05 的SARS-CoV S 蛋白同源表位序列匯總結(jié)果見表 3。

表2 多肽與 6 種人冠狀病毒 S 蛋白同源表位條數(shù)Table 2 The number of homologous epitopes between polypeptides and six human coronaviruse S proteins

表3 SARS-CoV S 蛋白與多肽同源的表位序列Table 3 The epitope sequences of SARS-CoV S protein homologous with polypetides

綜上，在生物信息學上多肽 S2、S3、S6、S7 具有抗原表位，也具有較好的特異性。

2.3 特異性多肽的理化性質(zhì)、疏水性及二級結(jié)構(gòu)分析

經(jīng) ProtParam 軟件分析，多肽的理化性質(zhì)，見表 4。由圖 1 可知，多肽 S2 氨基酸序列第 5 位疏水性最大值為 1.114，第 7 位親水性最大值為–0.843，整體親疏水性預測顯示，S2 為疏水性蛋白；多肽 S3 氨基酸序列第 8 位親水性最大值為–2.478，整體親疏水性預測顯示，S3 為親水性蛋白；多肽 S6 氨基酸序列第 17 位疏水性最大值為0.356，第 28 位親水性最大值為–1.389，整體親疏水性預測顯示，S6 為親水性蛋白；多肽 S7 氨基酸序列第 9 位親水性最大值為–1.456，整體親疏水性預測顯示，S7 為親水性蛋白。

圖1 特異性多肽親水性及疏水性分析（A：S2；B：S3；C：S6；D：S7）Figure 1 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of specific peptides (A:S2;B:S3;C:S6;D:S7)

表4 多肽理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical properties of peptides

經(jīng) SOPMA 軟件分析，S2 的二級結(jié)構(gòu)由100% 的無規(guī)卷曲組成；S3 二級結(jié)構(gòu)由 18.18%的無規(guī)卷曲、13.64% 的 α-螺旋、45.45% 的延伸鏈（β-折疊）及 22.73% 的 β-轉(zhuǎn)角組成；S6 二級結(jié)構(gòu)由 66.67% 的無規(guī)卷曲、22.22% 的延伸鏈及11.11% 的 β-轉(zhuǎn)角組成；S7 二級結(jié)構(gòu)由 40% 的無規(guī)卷曲、36% 的 α-螺旋、24% 的 β-轉(zhuǎn)角組成，見圖 2。

圖2 特異性多肽二級結(jié)構(gòu)分析（紫線代表無規(guī)則卷曲，藍線代表 α-螺旋，紅色線代表 β-折疊，綠色線代表 β-轉(zhuǎn)角）（A：S2；B：S3；C：S6；D：S7）Figure 2 Analysis of secondary structure of specific peptides (The purple line represents random coil,and the blue line represents α-helix,red line represents β-sheet,green line represents β-turn) (A:S2;B:S3;C:S6;D:S7)

上述結(jié)果表明，在生物信息學上多肽 S2、S3、S6、S7 具有較大占比的無規(guī)則卷曲與 β-轉(zhuǎn)角，多肽柔性較好，S3、S6、S7 具有親水性。

2.4 SARS-CoV-2 S 蛋白特異性多肽免疫反應性驗證結(jié)果

以 SARS-CoV-2 S 蛋白兔多抗作為陽性對照，健康新西蘭兔血清為陰性對照，P/N ≥ 2.1 為判定陽性反應標準（用酶標儀測定被檢溶液OD450nm值之后，計算出的實驗組血清與陰性血清之比。當其比值 ≥ 2.1 時，實驗組檢測結(jié)果呈陽性），分別檢測驗證這幾條多肽。結(jié)果顯示 S2、S3、S6、S7 均被判定為與 SARS-CoV-2 S 蛋白兔多抗有陽性反應，表明這 4 種多肽均具有抗原性?？乖詮娙蹴樞蛞来问?S6 >S2 >S3 >S7。在篩選多肽之初，發(fā)現(xiàn) S2 和 S3，S6 和 S7 在一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列上距離非常接近（特別是 S6 和 S7 距離小于10 個氨基酸），在 SARS-CoV S 蛋白上，它們之間有很大幾率存在空間結(jié)構(gòu)促進病毒與受體的結(jié)合。而且 S6、S7 位于 SARS-CoV-2 S 蛋白受體結(jié)合區(qū)，極有可能檢測到中和抗體。故本課題組設計分組時，S2 與 S3，S6 與 S7 各分成一組，考慮到多肽 S6、S7 的位置以及潛在應用價值，將 S6、S7 用蛋白柔性 linker 連接起來，構(gòu)建質(zhì)粒，用大腸埃希菌表達該小分子融合蛋白（S6-Linker-S7），用 ELISA 驗證其抗原性，發(fā)現(xiàn) S6-Linker-S7 比其他多肽抗原性更強（表 5）。

表5 ELISA 法驗證特異性多肽免疫反應性結(jié)果（OD450 nm）Table 5 Verification of specific peptide immunoreactivity by ELISA (OD450 nm)

2.5 SARS-CoV-2 S 蛋白特異性多肽免疫誘導血清ELISA 檢測 IgG 抗體結(jié)果

以未免疫的健康新西蘭兔血清為陰性對照，免疫 SARS-CoV-2 S 蛋白的新西蘭兔血清為陽性對照，P/N ≥ 2.1 為陽性判斷標準。表 6 結(jié)果顯示，S2-KLH、S3-KLH、S6-KLH、S7-KLH 免疫的兔血清均能與 SARS-CoV-2 S 蛋白產(chǎn)生免疫反應，反應結(jié)果均為陽性，表明 S2-KLH、S3-KLH、S6-KLH、S7-KLH 具有免疫原性，能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體。

表6 ELISA 法驗證特異性多肽免疫兔血清 IgG 抗體檢測結(jié)果（OD450 nm）Table 6 Test results of serum IgG antibody of rabbits immunized with specific peptide verified by ELISA (OD450 nm)

2.6 SARS-CoV-2 S 蛋白與 S6-Linker-S7 檢測普通呼吸疾病患者、COVID-19 抗體陽性患者血清IgG 抗體的結(jié)果

本課題組將普通呼吸疾病患者、COVID-19 抗體陽性患者的血清分別與 SARS-CoV-2 S 蛋白和S6-Linker-S7 反應的OD450nm數(shù)值做配對t檢驗，分析這兩種蛋白在檢測同一群體時是否有差異性。結(jié)果顯示 S6-Linker-S7 檢測普通呼吸系統(tǒng)疾病患者血清 IgG 抗體平均檢測值為（0.70 ± 0.34）。SARS-CoV-2 S 蛋白檢測普通呼吸系統(tǒng)疾病患者血清 IgG 抗體平均檢測值OD450nm為（1.33 ±0.54），差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），其中有 11 位普通呼吸系統(tǒng)疾病患者 SARS-CoV-2 S蛋白與 S6-Linker-S7 的檢測結(jié)果OD450nm值相差較大，見圖 3。

圖3 普通呼吸系統(tǒng)疾病患者 SARS-CoV-2 S 蛋白與S6-Linker-S7 蛋白血清 IgG 抗體檢測結(jié)果（P <0.001）Figure 3 Comparison of serum IgG antibody detection results of SARS-CoV-2 S protein and S6-Linker-S7 protein in patients with common respiratory diseases (P <0.001)

S6-Linker-S7 檢測 COVID-19 抗體陽性患者，血清抗體平均檢測值為（2.20 ± 1.95）。SARS-CoV-2 S 蛋白檢測 COVID-19 抗體陽性患者，血清抗體平均檢測值OD450nm為（2.35 ± 0.57），差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）見圖 4。

圖4 COVID-19 抗體陽性患者 SARS-CoV-2 S 蛋白與S6-Linker-S7 蛋白血清 IgG 抗體檢測結(jié)果比較（P >0.05）Figure 4 Comparison of serum IgG antibody detection results of SARS-CoV-2 S protein and S6-Linker-S7 protein in patients with positive COVID-19 antibody (P >0.05)

分析 S6-Linker-S7 分別檢測普通呼吸系統(tǒng)疾病患者與 COVID-19 抗體陽性患者血清IgG 抗體檢測值，做兩獨立樣本t檢驗，發(fā)現(xiàn) S6-Linker-S7在檢測 COVID-19 抗體陽性患者時，血清抗體檢測值OD450nm均值比檢測普通呼吸疾病患者高 3倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），見圖 5。

圖5 S6-Linker-S7 蛋白對不同人群血清 IgG 抗體檢測結(jié)果比較（P <0.001）Figure 5 Comparison of detection results of S6-Linker-S7 protein on serum IgG antibodies of different populations (P <0.001)

以上實驗表明 S6-Linker-S7 具有在實際應用中檢測 COVID-19 抗體陽性患者血清 IgG 抗體的能力。

2.7 多肽的特異性驗證結(jié)果

以未免疫的健康新西蘭兔血清為陰性對照，SARS-CoV-2 S 蛋白多克隆抗體為陽性對照，P/N≥ 2.1 為陽性判斷標準，結(jié)果如表 7、表 8所示，SARS-CoV-2 S 蛋白與 HCoV-HKU1、HCoV-OC43、SARS-CoV S 蛋白多克隆抗體產(chǎn)生免疫反應，反應結(jié)果呈陽性，表明 SARS-CoV-2 S 蛋白與這三種病毒的 S 蛋白抗體具有免疫交叉反應。S6-Linker-S7蛋白與抗 HCoV-OC43、SARS-CoV S 蛋白多克隆抗體產(chǎn)生免疫反應，反應結(jié)果呈陽性。與SARS-CoV-2 S 蛋白相比，S6-Linker-S7 蛋白避免了與 HCoV-HKU1 S 蛋白多抗的免疫交叉反應，雖然其與 HCoV-OC43、SARS-CoV S 蛋白多抗還是具有免疫交叉反應，但從OD450nm數(shù)值上看，S6-Linker-S7 蛋白與 HCoV-OC43、SARS-CoV S蛋白多抗的反應值比 SARS-CoV-2 S 蛋白低。表明S6-Linker-S7 蛋白與 SARS-CoV-2 S 蛋白相比具有更高的特異性。

表7 SARS-CoV-2 S 蛋白特異性檢測結(jié)果（OD450 nm）Table 7 Test results of SARS-CoV-2 S protein specificity (OD450 nm)

表8 S6-Linker-S7 蛋白特異性檢測結(jié)果（OD450 nm）Table 8 Test results of S6-Linker-S7 protein specificity (OD450 nm)

3 討論

面對 SARS-CoV-2 血清抗原抗體檢測因免疫交叉反應產(chǎn)生的“假陽性”結(jié)果的問題，本課題組針對 SARS-CoV-2 的 S 蛋白，基于生物信息學技術，設計合成了區(qū)別于 HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV、MERS-CoV的特異性多肽，并通過動物實驗和 SARS-CoV-2 S蛋白多克隆抗體檢測初步驗證了多肽的免疫原性和抗原性， 分析對比了 S6-Linker-S7 與SARS-CoV-2 S 蛋白在檢測普通呼吸系統(tǒng)疾病患者與 COVID-19 抗體陽性患者血清 IgG 抗體檢測值的差異，證明 S6-Linker-S7 在實際應用中的可行性，并用實驗驗證了 S6-Linker-S7 的特異性比SARS-CoV-2 S 蛋白高。為研發(fā)特異性更高的SARS-CoV-2 特異性抗體/抗原快速檢測試劑盒建立了基礎。

在篩選設計多肽之初，發(fā)現(xiàn) S6、S7 在一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列上距離相近且位于 SARS-CoV-2 S蛋白受體結(jié)合區(qū)，S6-Linker-S7 極有可能檢測到中和抗體?；谶@一猜想，下一步將使用基因重組人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）作為包被抗原，HRP 標記 S6-Linker-S7蛋白，建立競爭抑制法并與市面上出售新冠中和抗體檢測試劑盒對比檢測已接種疫苗的人群，判斷S6-Linker-S7 的臨床應用價值[22]。