劉杏，夏宇，李鑫，滿榮勇，王煒，曹建中

作者單位：410208 長沙，湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（劉杏、夏宇、李鑫、曹建中），藥學(xué)院（王煒）；418000 懷化，湖南省懷化市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（滿榮勇）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）[1-2]暴發(fā)后在全球造成大流行，促使人們再一次重視傳染病的危害和防治。尤其新發(fā)呼吸道病毒傳染性強(qiáng)，一旦暴發(fā)，傳播迅速，由于沒有有效治療方法，往往致死率高，嚴(yán)重危害人類健康，并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。其他常見危害人類的病毒性疾病有病毒性肝炎、流感、艾滋病、狂犬病等，尤其艾滋病和病毒性肝炎患者需要長期服藥，患者精神和經(jīng)濟(jì)壓力大。在傳染性疾病中，病毒感染約占 75%，所以對病毒性疾病的控制一直是生物醫(yī)學(xué)界的一大難點(diǎn)。

藥物依然是當(dāng)前控制病毒感染的主要方法，其抑制病毒生活史的某個(gè)環(huán)節(jié)，如直接抑制或殺滅病毒、阻止病毒侵入細(xì)胞、抑制病毒基因組復(fù)制、病毒顆粒釋放或增強(qiáng)宿主抗病毒能力等。以 SARS-CoV-2 為例，目前臨床使用的抗 SARS-CoV-2 藥物如核苷酸類似物法匹拉韋和瑞德西韋等[3]，靶向 RNA 依賴性 RNA 聚合酶（RdRp），阻斷病毒RNA 的合成；阿比朵爾[4]則是通過靶向 S 蛋白與其受體ACE2 的結(jié)合，阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞。這些藥物均只能部分抑制病毒復(fù)制，無法終止病毒感染，因此尋找新的有效的能夠直接終止病毒復(fù)制的藥物一直是病毒學(xué)研究的努力方向。最近興起的利用細(xì)胞各種蛋白酶降解系統(tǒng)降解病理蛋白的技術(shù)在腫瘤和神經(jīng)性疾病等領(lǐng)域取得了很大進(jìn)展，尤其以 26S蛋白酶系統(tǒng)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)靶向降解嵌合體（proteolysis targeting chimera，PROTAC）技術(shù)或藥物進(jìn)展迅速，已經(jīng)進(jìn)入臨床 II 期試驗(yàn)[5-6]，有望成為研發(fā)抗病毒藥物的利器?，F(xiàn)將 PROTAC技術(shù)的原理、現(xiàn)狀和在抗病毒方面的應(yīng)用前景作一個(gè)介紹。

1 PROTAC技術(shù)的原理與應(yīng)用

PROTAC 分子或藥物是一個(gè)異質(zhì)雙功能小分子，由一個(gè)結(jié)合靶蛋白的配體小分子和一個(gè)結(jié)合 E3 連接酶的配體小分子通過一個(gè)小分子鏈構(gòu)成[7]。PROTAC 分子進(jìn)入細(xì)胞后，同時(shí)與靶蛋白和 E3 連接酶結(jié)合，利用 E3 連接酶招募 E2 對靶蛋白進(jìn)行泛素化修飾，修飾后的靶蛋白通過26S 蛋白酶系統(tǒng)降解為氨基酸，釋放出來的 PROTAC 分子可以重復(fù)使用（圖 1）。PROTAC技術(shù)是一個(gè)顛覆傳統(tǒng)藥物概念的新技術(shù)，但是其應(yīng)用場景與傳統(tǒng)蛋白抑制劑一致。該技術(shù)最早發(fā)表于 2001年，此后一直由耶魯大學(xué) Crews教授實(shí)驗(yàn)室推動(dòng)并在近幾年得到其他藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)室跟蹤。和傳統(tǒng)藥物不同的是，PROTAC 藥物不是抑制靶蛋白活性，而是直接降解靶蛋白，因此其控制靶蛋白活性的效果優(yōu)于抑制劑。泛素-蛋白酶系統(tǒng)的正常生理功能是負(fù)責(zé)清除細(xì)胞中的變性、突變或有害蛋白[5]。一旦靶蛋白、PROTAC 分子、E3 泛素連接酶三元復(fù)合物形成，E2 泛素結(jié)合酶把泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白表面上的賴氨酸殘基，細(xì)胞內(nèi) 26S 蛋白酶體識別賴氨酸多聚泛素化信號進(jìn)而促進(jìn)了靶蛋白的降解（圖 1）。目前，PROTAC技術(shù)已經(jīng)用于靶向多種細(xì)胞蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子、骨架蛋白、酶和調(diào)節(jié)蛋白等[6]。在癌癥和神經(jīng)元疾病等領(lǐng)域，PROTAC 分子在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)異，部分 PROTAC 藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床 I 期或 II 期。這些進(jìn)展促使全球頂級制藥公司聯(lián)手新成立了 PROTAC 公司，開展PROTAC 藥物研發(fā)，相信不久的將來 PROTAC 藥物會(huì)不斷出現(xiàn)，用于治療人類的各種疾病。

圖1 PROTAC 原理

2 PROTAC技術(shù)的優(yōu)勢

PROTAC 的作用機(jī)制使得 PROTAC 分子在降解靶蛋白過程中具有兩個(gè)重要特征。首先是形成靶蛋白、PROTAC和 E3 泛素連接酶的三元復(fù)合物。PROTAC 分子對靶蛋白的降解具有濃度依賴性[8]：在 PROTAC 分子濃度較低時(shí)，靶蛋白被降解的程度隨濃度升高而逐漸提高；PROTAC分子濃度過高時(shí)，反而會(huì)出現(xiàn)靶蛋白水平回升。這是由于靶蛋白和 E3 泛素連接酶均被小分子占據(jù)，形成了二元復(fù)合物，降低了靶蛋白的降解效率。其次，PROTAC 分子對蛋白的降解起催化作用[9]，靶蛋白通過 26S 蛋白酶途徑降解后，PROTAC 分子被釋放出來，繼續(xù)參與降解下一個(gè)靶蛋白。因此，只需催化量的 PROTAC 分子就可以誘導(dǎo)靶蛋白降解。

大量研究發(fā)現(xiàn)，PROTAC技術(shù)具有以下顯著優(yōu)勢：①用量小；②較低的藥物暴露量降低了脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的可能性，減少毒副作用；③不會(huì)引起耐藥；④不依賴于蛋白活性中心親和力，可選擇性高；⑤沒有抑制劑和靶蛋白復(fù)合物堆積；⑥較少給藥次數(shù)；⑦更重要的是，由于 PROTAC 只需要結(jié)合活性，觸發(fā)靶蛋白與 E3 酶結(jié)合從而引發(fā)降解這一事件，屬于“事件驅(qū)動(dòng)”，與傳統(tǒng)的小分子抑制劑的“占位驅(qū)動(dòng)”不同，不需要直接抑制靶蛋白的活性，藥物不需要與靶蛋白長時(shí)間和高強(qiáng)度的結(jié)合，因此可以靶向傳統(tǒng)難以成藥的蛋白[10]。

目前，Pubmed 上已經(jīng)發(fā)表了 500 多篇關(guān)于 PROTAC技術(shù)的研究性論文，研究重點(diǎn)集中在腫瘤治療領(lǐng)域。2021年3月，美國 Arvinas 公司宣布其開發(fā)的用于治療前列腺癌的雄激素受體 AR 降解藥物 ARV-110 和 ARV-471 進(jìn)入II 期臨床試驗(yàn)，標(biāo)志著 PROTAC技術(shù)的研究進(jìn)入新的階段。表 1 總結(jié)了已經(jīng)報(bào)道的重要 PROTAC 小分子化合物，以及對應(yīng)的靶蛋白和 E3 配體分子[11]。

表1 在研 PROTAC 藥物

3 PROTAC 在中藥抗病毒中的應(yīng)用前景

根據(jù)文獻(xiàn)查詢，PROTAC技術(shù)尚沒有引起中醫(yī)藥領(lǐng)域的重視，尚未見在中醫(yī)藥方面的應(yīng)用，因此我們針對中藥抗病毒的作用靶點(diǎn)，探討 PROTAC技術(shù)在中藥抗病毒中的應(yīng)用前景。

中藥治療病毒性疾病尤其急性感染的效果很好，且副作用相較化學(xué)藥物來說要小很多，然而也面臨很大挑戰(zhàn)。首先，關(guān)于中藥抗病毒作用的有效成分鑒定及潛在靶點(diǎn)的報(bào)道很多，然而有關(guān)生物學(xué)機(jī)制探討不多；其次，對于 HIV-1 和HBV 這類慢性感染，缺少有效根治方法，患者需終身服藥，精神和經(jīng)濟(jì)壓力大。利用 PROTAC技術(shù)改造中藥抗病毒小分子可以提高藥物療效。現(xiàn)有抗病毒中藥小分子主要是抑制劑，通過改造成 PROTAC 藥物，理論上可以使用較小的劑量，直接降解靶蛋白，從而終止病毒復(fù)制。PROTAC技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜以及 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)，為進(jìn)一步探討藥物作用機(jī)制、提高療效提供基礎(chǔ)。一些中藥小分子具有結(jié)合病毒非酶類蛋白的功能，然而這種結(jié)合對于病毒的治療有何作用尚不清楚，利用 PROTAC 改造后的小分子藥物可以直接降解這些靶標(biāo)蛋白，明確藥物靶點(diǎn)。PROTAC 和酶抑制劑不一樣，其藥物分子能反復(fù)利用，對于慢性感染具有特別的意義，可以降低服藥次數(shù)，減少副作用。針對某些感染，PROTAC 藥物可以和中藥方劑聯(lián)用，提高其治療效果。

以葉下珠這一中藥為例，研究表明其通過活性成分沒食子酸葡萄糖苷結(jié)合核衣殼蛋白 preC 而抑制乙肝病毒的復(fù)制[32]，如果將沒食子酸葡萄糖苷改造成 PROTAC 分子，就可以直接降解 preC，改善患者癥狀。

要充分發(fā)揮 PROTAC技術(shù)在中藥小分子藥物抗病毒中的潛力，需要面對以下挑戰(zhàn)。首先，篩選合適的靶標(biāo)和藥物。目前在體外抑制病毒復(fù)制的中藥活性成分有很多，部分藥物的分子結(jié)構(gòu)已經(jīng)鑒定（表 2）。由于 PROTAC 分子依然是小分子，所以分子量小的生物利用度相對較高，比如大黃酸、麻黃素、氧化苦參堿等最有可能利用 PROTAC 改造，成為療效更好的抗病毒藥物。對于病毒感染尤其慢性感染，靶向病毒復(fù)制有關(guān)酶類如蛋白酶和復(fù)制酶，抗病毒效果會(huì)比較理想。其次，病毒感染往往引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，過多的炎癥和細(xì)胞因子“風(fēng)暴”會(huì)導(dǎo)致組織與器官損傷，因此控制炎癥和細(xì)胞因子在適當(dāng)水平是非常重要的，利用 PROTAC 藥物靶向炎癥因子有可能達(dá)到需要的目標(biāo)。

表2 抗病毒中藥小分子

最后，如表 1所示，除了靶標(biāo)，PROTAC 藥物的 E3酶及其配體也是影響藥物效果的重要因素，人類基因組編碼超過 400 個(gè) E3 酶，目前研究較多的不到 10 個(gè)，有合適配體而且用在 PROTAC 藥物上面的以 CRBN、IAP 和VHL 為主，這些酶在病毒感染細(xì)胞中的表達(dá)水平尚沒有報(bào)道，因此研究清楚這些酶在病毒感染細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化，對于采用合理的 E3 酶及其配體設(shè)計(jì)中藥 PROTAC 小分子治療病毒性疾病具有重大意義。

PROTAC技術(shù)是目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一大革命性技術(shù)，在中藥抗病毒領(lǐng)域具有非常好的前景，不僅可以解決靶標(biāo)不清的問題，而且具有極大地提高療效的潛力。利用這一技術(shù)，可以進(jìn)一步提高中醫(yī)藥在抗病毒領(lǐng)域的價(jià)值，為人類健康做出更大貢獻(xiàn)。