曲守方，黃傳峰，張文新，孫楠，于婷，黃杰

作者單位：100050 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院非傳染病診斷試劑室（曲守方、張文新、孫楠、于婷、黃杰）；理化檢測(cè)室（黃傳峰）

乳腺癌和卵巢癌是女性發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，5%～10% 的乳腺癌患者和 10%～15% 的卵巢癌患者為家族性或遺傳性癌癥。這兩種家族性或遺傳性癌癥與乳腺癌易感基因 1（breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1）和乳腺癌易感基因 2（BRCA2）的突變密切相關(guān)[1-2]。BRCA1 基因定位于 17q21，含有 23 個(gè)外顯子，編碼 1863 個(gè)氨基酸；BRCA2 基因定位于 13q13，含有 27 個(gè)外顯子，編碼 3418 個(gè)氨基酸[3]。BRCA1 和 BRCA2基因均為抑癌基因，編碼蛋白通過(guò)同源重組通路修復(fù)雙鏈 DNA，聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）通過(guò)堿基切除修復(fù)通路修復(fù)單鏈 DNA 損傷[4]，這兩種 DNA 損傷修復(fù)機(jī)制缺陷會(huì)造成細(xì)胞基因組嚴(yán)重不穩(wěn)定進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響基因組穩(wěn)定性，并引起多種癌癥的發(fā)生。攜帶 BRCA1/BRCA2 致病胚系突變的健康女性乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。BRCA 基因作為一種重要的生物標(biāo)志物，可以用于女性乳腺癌、卵巢癌以及其他癌癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。PARP 抑制劑能靶向殺傷 BRCA1/2 缺陷的腫瘤細(xì)胞，具有 BRCA 有害突變的卵巢癌患者對(duì)鉑類(lèi)化療更加敏感并且可以獲益于 PARP 抑制劑的治療[5-6]。因此檢測(cè) BRCA基因突變，確定腫瘤患者的藥物敏感性，可以幫助臨床醫(yī)生選擇個(gè)體化靶向藥物治療方案。

BRCA1 和 BRCA2 基因突變形式多樣，而且突變位點(diǎn)散布于基因的整個(gè)編碼區(qū)，但是沒(méi)有熱點(diǎn)突變，也沒(méi)有熱點(diǎn)區(qū)域。最常見(jiàn)的致病性突變?yōu)樾∑稳笔Щ虿迦牖蛞拼a突變，也有剪切點(diǎn)突變及大片段基因重排現(xiàn)象，還包括錯(cuò)義突變、沉默突變及基因多態(tài)性等其他形式的突變，但臨床如何解讀這些位點(diǎn)的致病潛能仍有困難。BRCA1/2 基因突變檢測(cè)方法有多種，包括 Sanger 測(cè)序、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、染色體微陣列分析（chromosomal microarray，CMA）或微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridisation，aCGH）等[7]。傳統(tǒng)的一代測(cè)序結(jié)合 MLPA 檢測(cè)大片段缺失/重復(fù)導(dǎo)致的重排不僅繁瑣，而且成本高和通量低。隨著下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)的飛速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室已將 NGS 技術(shù)應(yīng)用于 BRCA 基因變異的臨床檢測(cè)[8-10]。因此亟需有完善的標(biāo)準(zhǔn)化體系用于評(píng)估基于 NGS 的 BRCA基因突變檢測(cè)試劑盒的性能。本研究使用 BRCA基因突變國(guó)家參考品，對(duì) BRCA1/2 基因突變檢測(cè)試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法）的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，實(shí)現(xiàn)對(duì)BRCA基因突變檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 BRCA基因突變國(guó)家參考品 包括 25 個(gè)樣本，來(lái)源于基因編輯細(xì)胞系樣本、有家族史的腫瘤患者或者攜帶者樣本以及正常人樣本，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.1.2 試劑 BRCA1/2 基因突變檢測(cè)試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)試劑盒）購(gòu)自華大生物科技（武漢）有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 和 Qubit ssDNA Assay Kit 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法）購(gòu)自華大生物科技（武漢）有限公司。

1.1.3 設(shè)備 Qubit 3.0 熒光定量?jī)x購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems 公司；BGISEQ-500 基因測(cè)序儀購(gòu)自深圳華大智造科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 文庫(kù)的構(gòu)建 取國(guó)家參考品的基因組DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作方法，經(jīng)過(guò)打斷和末端修復(fù)、接頭連接、pre-PCR 擴(kuò)增、BRCA 基因特異性探針雜交捕獲以及 post-PCR 擴(kuò)增等步驟進(jìn)行 DNA 文庫(kù)制備。使用 Qubit 3.0 熒光定量?jī)x和Qubit dsDNA HS Assay Kit 進(jìn)行 DNA 定量。

1.2.2 測(cè)序反應(yīng) 根據(jù)文庫(kù)濃度，等量混合后進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)，制備 DNA 納米球（DNA nanoball,DNB），用 Qubit ssDNA Assay Kit 和 Qubit 熒光定量?jī)x，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行濃度測(cè)定。DNB 濃度 ≥ 8 ng/μl 為合格標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)濃度低于 8 ng/μl 的DNB 需重新制備，對(duì)濃度高于 40 ng/μl 的 DNB需用 DNB 加載緩沖液 I 稀釋到 20 ng/μl。然后放置芯片，進(jìn)行 DNB 加載。使用測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法），在 BGISEQ-500基因測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。將得到的原始下機(jī)數(shù)據(jù)使用遺傳性 BRCA 基因分析注釋軟件分析，獲得國(guó)家參考品的 BRCA 基因變異信息。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性和特異性

BRCA基因突變國(guó)家參考品說(shuō)明書(shū)規(guī)定按照BRCA 基因解讀規(guī)則進(jìn)行解讀，將變異的臨床意義分為5 類(lèi)：Class5（致病突變，Pathogenic），Class4（疑似致病突變，Likely pathogenic），Class3（意義未明變異，VUS），Class2（疑似良性變異，Likely benign），Class1（良性變異，Benign）。而 Class5 和Class4 對(duì)于臨床決策是不存在差異的。按照國(guó)家參考品說(shuō)明書(shū)中的判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)解讀結(jié)果進(jìn)行評(píng)判（表 1）。結(jié)果顯示試劑盒能準(zhǔn)確檢出國(guó)家參考品樣本中 BRCA基因突變位點(diǎn)，也沒(méi)有檢出其他非標(biāo)示的致病性或疑似致病性突變位點(diǎn)；部分位點(diǎn)的試劑盒解讀結(jié)果與標(biāo)示解讀結(jié)果有差異，但是不納入解讀錯(cuò)誤，所有突變位點(diǎn)的解讀結(jié)果正確，見(jiàn)表 2。

表1 判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Determination criteria

表2 國(guó)家參考品的檢測(cè)及突變解讀結(jié)果Table 2 The detection and mutation interpretation result for national reference material

BRCA1:K1183R_1 樣本為國(guó)家參考品第一個(gè)樣本，結(jié)果顯示該樣本的 BRCA2 基因 11 號(hào)外顯子（EX11）發(fā)生雜合缺失突變（c.5351delA），導(dǎo)致 p.Asn1784Thrfs*7 的突變，試劑盒的解讀結(jié)果為疑似致病突變（Class4-Likely pathogenic），國(guó)家參考品標(biāo)示的解讀結(jié)果為致病突變（Class5-Pathogenic），根據(jù)表 1 判斷該樣本的解讀結(jié)果是正確的，為 BRCA基因突變陽(yáng)性；BRCA1 基因的 10 號(hào)外顯子（EX10）發(fā)生p.Lys1183Arg 的突變，解讀結(jié)果為良性變異（Class1-Non pathogenic）；BRCA1 基因的 10 號(hào)外顯子（EX10）發(fā)生 p.Asp435Tyr 的突變，解讀結(jié)果為意義未明變異（Class3-VUS）。而且除標(biāo)示位點(diǎn)外，該樣本未檢出已知致病突變及疑似致病突變，符合特異性的要求，見(jiàn)圖 1。

圖1 BRCA1:K1183R_1 結(jié)果Figure 1 The result of BRCA1:K1183R_1

2.2 重復(fù)性

重復(fù)性是在測(cè)量條件保持不變的情況下，連續(xù)多次測(cè)量結(jié)果之間的一致性，是試劑盒重要的性能指標(biāo)。使用同一批次試劑盒，平行檢測(cè) 3 套國(guó)家參考品，每個(gè)樣本的 3 次結(jié)果均一致，即樣本的BRCA基因突變位點(diǎn)能準(zhǔn)確檢出，解讀結(jié)果也是正確的，沒(méi)有檢出其他非標(biāo)示的致病性或疑似致病性突變位點(diǎn)。

3 討論

遺傳性乳腺癌和卵巢癌綜合征（HBOC）是一種腫瘤易感性綜合征，主要由 BRCA1/2 基因致病變異引起。BRCA1/2 驅(qū)動(dòng)的 HBOC 與多種類(lèi)型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加是相關(guān)的，包括胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤等。研究報(bào)道攜帶 BRCA1 基因缺陷的女性罹患乳腺癌的終身患癌風(fēng)險(xiǎn)為 72%，罹患卵巢癌的終身患癌風(fēng)險(xiǎn)為 44%；攜帶 BRCA2 基因缺陷的女性罹患乳腺癌的終身患癌風(fēng)險(xiǎn)為 69%，罹患卵巢癌的終身患癌風(fēng)險(xiǎn)為 17%。具有 BRCA1/2 突變的卵巢癌患者可獲益于 PARP 抑制劑的治療。目前已經(jīng)獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的PARP 抑制劑，包括奧拉帕利（olaparib，Lynparza）和魯卡帕利（rucaparib，Rubraca）[11-12]。

雖然 BRCA1/2 基因序列較長(zhǎng)，變異形式多樣，但并不是所有的 BRCA 變異都會(huì)損傷蛋白質(zhì)功能，絕大多數(shù)變異并不會(huì)增加個(gè)人患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[13-14]。因此對(duì)于 BRCA基因突變檢測(cè)產(chǎn)品的性能評(píng)價(jià)，不僅需要 BRCA 變異的準(zhǔn)確檢測(cè)，而且對(duì) BRCA 變異的正確解讀也是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，需要建立我國(guó)的 BRCA 變異檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化體系。在 BRCA 變異的解讀方面，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南[15]將 BRCA 變異分為 5 類(lèi)（Class5～1），分別為致病突變、疑似致病突變、意義未明突變、疑似良性變異和良性變異。其中致病性突變（Class5）和疑似致病性的突變（Class4）可認(rèn)為是有害變異，有害變異可獲益于PARA 抑制劑類(lèi)藥物。盡管 ACMG 指南提供了指導(dǎo)性的意見(jiàn)和建議，但是變異解讀需要依據(jù)各類(lèi)信息（包括來(lái)自群體數(shù)據(jù)庫(kù)、疾病數(shù)據(jù)庫(kù)、文獻(xiàn)和患者病史的信息）進(jìn)行綜合評(píng)判，因此準(zhǔn)確定義這些變異的臨床意義還面臨著巨大的挑戰(zhàn)。目前中國(guó)食品藥品檢定研究院建立的 BRCA基因突變國(guó)家參考品，不僅對(duì)試劑盒的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，即要求試劑盒能夠準(zhǔn)確地檢出變異；同時(shí)也評(píng)價(jià)生物信息分析流程和數(shù)據(jù)解讀流程，要求試劑盒能夠正確解讀出該變異。本研究結(jié)果表明國(guó)家參考品能夠評(píng)價(jià)基于NGS 平臺(tái)的 BRCA基因突變檢測(cè)試劑盒的性能，實(shí)現(xiàn)對(duì) BRCA基因突變檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化工作，具有重要的指導(dǎo)意義。