楊適齊 張晏培 藍(lán)睿祺

研究背景及思路

瘧疾每年全球范圍內(nèi)導(dǎo)致超過40萬人死亡，同時帶來約27億美元的經(jīng)濟損失。瘧疾的主要傳播媒介是按蚊。按蚊必須吸食至少一種脊椎動物的血液才能啟動自身的卵子發(fā)生途徑。按蚊吸血后數(shù)小時內(nèi)，血液淋巴中的氨基酸水平顯著升高，進(jìn)而激活雷帕霉素靶點（the target of rapamycin，TOR）信號通路。TOR蛋白激活下游靶蛋白S6激酶（S6K），使其磷酸化，經(jīng)過一系列信號分子，最終刺激蛋白質(zhì)翻譯并啟動按蚊卵子發(fā)育并產(chǎn)卵。

除了為生殖提供營養(yǎng)外，交叉吸食宿主的血液使按蚊成為瘧疾的有效媒介。入侵的瘧原蟲在感染后數(shù)小時內(nèi)引起按蚊體內(nèi)基因表達(dá)譜的整體改變，特別是免疫相關(guān)基因。按蚊免疫系統(tǒng)由體液免疫和細(xì)胞免疫組成。瘧原蟲感染宿主后，會導(dǎo)致其先天免疫系統(tǒng)從基礎(chǔ)靜止?fàn)顟B(tài)到高活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，從而引起一系列轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的顯著改變。由此，感染瘧原蟲的按蚊對糖類物質(zhì)和血液中氨基酸攝取量增加，按蚊自身繁殖力反而下降。

按蚊代謝信號通路如何與免疫系統(tǒng)相互作用的機制尚不清楚。已有證據(jù)表明，斯氏按蚊（傳瘧按蚊的一種）TOR信號通路與免疫信號通路之間的交互作用決定其傳播瘧疾的能力。抑制TOR信號通路能夠上調(diào)免疫應(yīng)答，從而增強按蚊對瘧原蟲感染的抵抗力。

研究過程及結(jié)果

研究過程

研究過程及實驗方法見圖1。

研究結(jié)果

TOR信號通路刺激按蚊產(chǎn)卵

血液中的營養(yǎng)物質(zhì)可以直接激活TOR信號通路，或者通過抑制TOR復(fù)合物的負(fù)調(diào)控因子TSCl，從而間接調(diào)控TOR信號通路。繼而通過磷酸化下游蛋白S6K，實現(xiàn)對產(chǎn)卵相關(guān)蛋白合成的促進(jìn)。換言之，S6K的磷酸化水平可以被視為TOR信號通路活性的有力檢測指標(biāo)。

瘧原蟲感染損害按蚊生殖產(chǎn)卵

按蚊在感染瘧原蟲后生殖能力顯著下降。我們首先檢測了感染瘧原蟲后對于蚊蟲生殖能力的影響。分別對健康蚊蟲喂食了正常小鼠血液及瘧原蟲感染的小鼠血液，幾天后，觀察對比2組蚊蟲的產(chǎn)卵數(shù)目。與對照組相比，喂食瘧原蟲感染血液使得蚊蟲產(chǎn)卵數(shù)量顯著下降。這一結(jié)果也驗證了我們實驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性。那么，抑制按蚊產(chǎn)卵會對瘧原蟲產(chǎn)生什么影響呢？

雷帕霉素處理會抑制TOR通路，同時增強按蚊對瘧原蟲感染的抵抗能力

研究瘧原蟲感染與按蚊產(chǎn)卵關(guān)系的第一步，就是研究TOR信號通路對瘧原蟲感染的影響。已知雷帕霉素是TOR復(fù)合物的強抑制劑，我們首先通過對按蚊進(jìn)行雷帕霉素處理，成功抑制TOR通路。接著使用伯氏瘧原蟲感染雷帕霉素處理過的按蚊，可以觀察到雷帕霉素處理使得S6K激酶的磷酸化水平被顯著抑制，證明TOR通路被有效抑制。與此同時，我們也觀察到按蚊的中腸段瘧原蟲卵囊數(shù)也明顯下降。

基于以上實驗結(jié)果，我們假設(shè)雷帕霉素對于感染的瘧原蟲沒有副作用影響，那么按蚊對于瘧原蟲感染抵抗能力的顯著增強很可能是由于雷帕霉素對于按蚊TOR通路的抑制作用導(dǎo)致的。

RNA干擾會抑制TOR通路，同時增強按蚊對瘧原蟲感染的抵抗能力

為了進(jìn)一步深入研究，同時排除雷帕霉素的副作用影響，我們采用雙鏈RNA介導(dǎo)的RNA干擾手段，對TOR基因進(jìn)行了特異性敲低。敲低處理使得TOR基因表達(dá)水平下降了44.5%。與此同時，我們還觀察到S6K激酶磷酸化水平顯著下降了。相似的，伴隨著TOR基因表達(dá)水平的下降，RNA干擾也使得按蚊的中腸段瘧原蟲卵囊數(shù)明顯下降，對照組中瘧原蟲卵囊中位數(shù)每只按蚊12個，而dsTOR處理后的實驗組，平均每只按蚊中腸段中的瘧原蟲中位數(shù)僅有2個。這證明了抑制TOR通路確實可以增強按蚊對瘧原蟲感染的抵抗能力。

TOR通路的激活會增大按蚊感染瘧原蟲的可能性

假設(shè)TOR通路的抑制會增強按蚊對于瘧原蟲感染的抵抗能力，那么我們預(yù)期，TOR通路活性的增強將會促進(jìn)瘧原蟲在按蚊體內(nèi)的存活。為了檢驗這一假設(shè)是否準(zhǔn)確，我們敲低了TOR信號通路的負(fù)調(diào)控因子——TSCl基因表達(dá)水平。通過感染瘧原蟲，發(fā)現(xiàn)S6K激酶的磷酸化水平明顯升高，證明TOR通路的活性增強。相應(yīng)的，TOR通路的活性增強也伴隨著按蚊的中腸段瘧原蟲卵囊中位數(shù)明顯升高，從對照組的0個/只到實驗組的31個/只。

雷帕霉素處理調(diào)節(jié)按蚊對瘧原蟲感染的免疫響應(yīng)

注射雷帕霉素抑制TOR通路后，很多與按蚊免疫響應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)，如TEP1、REL2等。這一結(jié)果揭示了TOR通路極有可能與按蚊免疫響應(yīng)有密切關(guān)系。根據(jù)研究數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理使得按蚊TOR通路被抑制，從而使按蚊生殖產(chǎn)卵能力大大下降，與此同時，按蚊對于瘧原蟲感染的免疫應(yīng)答能力顯著增強。

雷帕霉素處理改變按蚊應(yīng)對瘧原蟲感染的免疫基因轉(zhuǎn)錄水平

按蚊傳播感染瘧原蟲能力主要取決于一些免疫蛋白，包括TEP1、LRIMl和APLl等。其中，TEP1是主要負(fù)責(zé)裂解寄生蟲卵囊的蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步確認(rèn)按蚊對瘧原蟲感染的抵抗能力與TEP1蛋白功能之間的關(guān)系，我們先特異性敲低了TEP1基因表達(dá)水平，接著分析經(jīng)過雷帕霉素處理后的按蚊瘧原蟲感染率的高低。我們發(fā)現(xiàn)，TEP1的沉默大大削弱了按蚊經(jīng)雷帕霉素處理引起的瘧原蟲感染免疫作用。這些結(jié)果表明，在按蚊感染瘧原蟲的過程中，阻遏TOR信號通路會使得按蚊免疫反應(yīng)在轉(zhuǎn)錄水平上有劇烈的改變。也就是蚊蟲的產(chǎn)卵生殖能力與其免疫反應(yīng)作用存在著密切相關(guān)、相互影響的聯(lián)系。

結(jié)果與討論

蚊子通過吸血才能完成產(chǎn)卵等生殖周期。一方面，血液來源和一次吸血總量會影響雌蚊產(chǎn)卵;另一方面，瘧原蟲進(jìn)入按蚊腸道后會激發(fā)按蚊宿主的免疫反應(yīng)。而按蚊通過這一系列免疫反應(yīng)清除入侵的瘧原蟲防止自身受到傷害。然而，按蚊生殖產(chǎn)卵和免疫反應(yīng)的激活都需要營養(yǎng)物質(zhì)。所以，這些營養(yǎng)物質(zhì)是如何在生殖產(chǎn)卵和免疫反應(yīng)之間平衡的？另外，能否通過改變營養(yǎng)平衡，在減少按蚊生殖產(chǎn)卵的同時，提高按蚊的免疫反應(yīng)從而抑制瘧原蟲繁殖呢？

我們首先通過顯微注射藥物雷帕霉素于按蚊體內(nèi)抑制TOR通路。通過Western blot雜交實驗證明，雷帕霉素處理能阻遏TOR通路，比如TOR的下游靶蛋白——磷酸化的S6K激酶被顯著抑制了。在按蚊產(chǎn)卵能力下降的同時，瘧原蟲卵囊的數(shù)量也相應(yīng)減少了。

但是，雷帕霉素是直接作用于瘧原蟲，還是通過抑制蚊蟲的TOR通路作用于瘧原蟲，從而使得卵囊數(shù)量減少的呢？我們選擇了顯微注射靶向TOR基因的雙鏈RNA抑制TOR的表達(dá)水平。逆轉(zhuǎn)錄PCR的實驗結(jié)果顯示通過RNA干擾，降低了約一半TOR基因表達(dá)水平。當(dāng)然，磷酸化的S6K激酶也被顯著抑制了。更進(jìn)一步的，在按蚊產(chǎn)卵能力下降的同時，瘧原蟲卵囊的數(shù)量也相應(yīng)減少。

既然抑制TOR通路能顯著降低瘧原蟲數(shù)量，那么激活TOR通路對瘧原蟲數(shù)量又有什么影響呢？為此，我們通過顯微注射雙鏈RNA的技術(shù)敲低TOR的負(fù)調(diào)控因子TSCl從而激活TOR信號通路。Western雜交實驗結(jié)果顯示，敲低TSCl導(dǎo)致S6K激酶的磷酸化水平顯著提高。更重要的是，瘧原蟲卵囊數(shù)量也有明顯的增加。

那么，干擾TOR通路之后為什么會導(dǎo)致卵囊數(shù)的降低呢？已知TEPl是按蚊清除瘧原蟲的重要免疫效應(yīng)分子，所以我們嘗試通過注射雙鏈RNA技術(shù)敲低TEPl。實驗結(jié)果表明，無論是在RNA還是蛋白質(zhì)水平，TEPl都被顯著抑制。敲低TEPl后，再用雷帕霉素處理后，我們發(fā)現(xiàn)按蚊對瘧原蟲的易感性上調(diào)，這證明干擾TOR通路抑制瘧原蟲感染確實是通過調(diào)控免疫分子實現(xiàn)的。這將為我們把雷帕霉素推向臨床，用于按蚊傳瘧能力防治與控制提供有力的理論依據(jù)。