蛋白質(zhì)氧化和酶對草魚重組魚肉品質(zhì)及體外模擬消化的影響

孟 粉，秦求思，董 燁，毛海萍，戴志遠，2，3*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州310012 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 大連工業(yè)大學(xué) 遼寧大連116034）

草魚是我國較為普遍的淡水魚，因生長速度快，飼料效率高，營養(yǎng)價值高，價格相對低廉而被青睞。魚類蛋白質(zhì)氧化為近年來研究的熱點之一，蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致氨基酸殘基側(cè)鏈的氧化修飾、肽鏈的斷裂、蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)等[1]。趙冰等[2]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化使流變學(xué)特性降低，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞；岳開華等[3]研究發(fā)現(xiàn)羥自由基氧化能改變海鱸魚肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其乳化性能下降；劉娟等[4]研究發(fā)現(xiàn)氧化會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)；李學(xué)鵬等[5]研究發(fā)現(xiàn)羥自由基氧化使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生交聯(lián)和聚集，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生顯著變化，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變疏松，進而對肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)和持水性產(chǎn)生一定影響；王漢玲等[6]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化可以改變草魚肌原纖維蛋白理化特性，導(dǎo)致其肌肉保水性能下降。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，簡稱TGase，EC.2.3.2.13）是一種具有很強交聯(lián)能力的酶[7]，可以改善食品的口感、風(fēng)味、質(zhì)地等，沒有副產(chǎn)物生成，且不會使?fàn)I養(yǎng)成分損失[8-9]，被廣泛用于水產(chǎn)品加工、肉制品加工、乳制品加工中等。TGase可以催化蛋白質(zhì)上的ε-氨基與谷氨酸的γ-羥酰胺行成蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，以增強蛋白質(zhì)凝膠性能[10]。陳秋妹等[11]研究發(fā)現(xiàn)TGase 可以催化魚肉蛋白與大豆蛋白發(fā)生共價交聯(lián)，顯著提高重組魚排的凝膠特性和持水能力；何曉萌[12]研究發(fā)現(xiàn)TGase 可以促進肌原纖維蛋白交聯(lián)，進而提高混合魚糜的凝膠特性；鄭雅爻等[13]研究發(fā)現(xiàn)TGase 可使鰱魚皮明膠膜具有更致密均勻的表面結(jié)構(gòu)；馬靜蓉等[14]研究發(fā)現(xiàn)TGase 和輔料可以提高鳶烏賊魚糜凝膠特性；程琳麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)TGase 具有明顯的保水作用，當(dāng)TGase 質(zhì)量分數(shù)在0.6%時能有效保持魚肉的持水性能，提高魚肉品質(zhì)。

氧化和TGase 均會促進蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)，蛋白質(zhì)分子的聚集會影響重組魚肉品質(zhì)和消化性[16]，因此有必要探究蛋白質(zhì)氧化和TGase 對其品質(zhì)及體外模擬消化的影響。張海璐等[17]研究發(fā)現(xiàn)隨著蛋白質(zhì)氧化時間的延長，持水性、凝膠特性和質(zhì)構(gòu)特性均降低；姜晴晴等[18]研究發(fā)現(xiàn)羥自由基氧化體系可以加速帶魚蛋白質(zhì)和脂肪的氧化，但適度的氧化對高蛋白質(zhì)體外消化率有促進作用。本研究通過測定質(zhì)構(gòu)、色差、持水力來探究蛋白質(zhì)氧化和TGase 對重組魚肉品質(zhì)的影響；通過測定干物質(zhì)消化率、蛋白質(zhì)消化率、BCA蛋白濃度來探究蛋白質(zhì)氧化和TGase 對重組魚肉體外消化的影響，為草魚的保鮮貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚、NaCl（食品級），購于杭州教工路物美超市。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（食品級），江蘇一鳴生物有限公司；黏蛋白酶、過氧化物酶等（生物試劑），美國Sigma 公司；胃蛋白酶、胰酶等（生物試劑），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；KCl、KSCN、NaHCO3等（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；BCA 試劑盒（生物試劑），碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（BSA124S-CW），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；恒溫水浴鍋（JOANLAB），寧波市群安實驗儀器有限公司；美的多功能電磁爐，美的集團有限公司；紫外可見分光光度計，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；均質(zhì)機（FJ200-S），上海力辰科技有限公司；酶標儀（SPECTRA MAX190），美國分子儀器有限公司；冷凍離心機（HETTICH 420R），德國HETTICH 公司；質(zhì)構(gòu)儀（TMS-PRO），美國FTC 公司；色差儀（Color Quest XE），美國HunterLab 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 草魚魚肉重組 對照組樣品：向草魚碎肉中加入2.0% NaCl，機器混勻，入模（4 cm×4 cm×4 cm）后40 ℃水浴凝膠3 h；試驗組樣品：向草魚碎肉中加入2.0% NaCl 和1 U/g TGase，機器混勻，入模（4 cm×4 cm×4 cm）后40 ℃水浴凝膠3 h。水浴結(jié)束后，于4 ℃冰箱過夜，次日沸水浴100 min。

1.3.1.2 重組魚肉氧化處理 參考Huang 等[19]的方法并適當(dāng)修改，將預(yù)處理后的重組魚肉樣品均勻切成4 份，吸干其表面水分，置于Fenton 氧化體系（1.0 mmol/L FeCl3、10 mmol/L H2O2和0.1 mmol/L 抗壞血酸（Ascorbic Acid）），樣品與氧化液比例為2∶1（g/L）。分別于25 ℃恒溫水浴中密封避光氧化 0，1，3，5 h，添加1.0 mmol/L EDTA 溶液10 mL，螯合氧化體系中剩余的Fe2+，終止反應(yīng)。置于4 ℃冰箱中2 h 后備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取及氧化性測定 參考Lin 等[20]方法并適當(dāng)修改，取1.3.1.2 節(jié)中的重組魚肉2 g，加入20 mL 超純水，均質(zhì)并離心，向沉淀中加入20 mL 50 mmol/L KCl，均質(zhì)并離心，沉淀用20 mL 0.6 mol/L KCl- 20 mmol/L Tris-馬來酸（pH 7.0）溶解，均質(zhì)后于4 ℃提取1 h，離心取上清液。上述所有均質(zhì)條件為：10 000 r/min、30 s；離心條件為：4 ℃、8 000×g、10 min。

1.3.2.1 羰基含量的測定 參考顏明月[21]、Koutina等[22]方法并適當(dāng)修改，取1.3.2 節(jié)中的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-馬來酸（pH 7.0）稀釋至2 mg/mL，加入1 mL 10 mmol/L DNPH，空白組加入1 mL 2 mol/L HCl。在磁力攪拌器上37 ℃攝氏度水浴1 h，結(jié)束后加入1 mL 20% TCA 溶液，再水浴10 min，然后離心，用1 mL 1∶1 的乙醇-乙酸乙酯（V/V）洗滌沉淀3 次，用3 mL 6 mol/L 鹽酸胍溶解沉淀，37 ℃水浴30 min，離心，取上清液，測其在370 nm 處的吸光值，每個樣品平行測定3 次。上述所有離心條件為：4 ℃、8 000×g、10 min。

1.3.2.2 總巰基含量的測定 取1.3.2 節(jié)中提取的肌原纖維蛋白溶液用0.6 mol/L KCl-20 mmol/LTris-馬來酸（pH 7.0）稀釋至5 mg/mL?？値€基含量的測定參照曹淑敏等[23]、儀淑敏等[24]方法。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性的測定 參考Chanarat 等[25]方法并適當(dāng)修改，利用質(zhì)構(gòu)儀程序中TPA 進行測定。將氧化后的重組肉切成2 cm×2 cm×2 cm 的正方體，采用P5 圓柱形探頭測定，每個樣品平行測定3 次。TPA 參數(shù)設(shè)置為：測試速度：60 mm/min；觸發(fā)力：0.1 N；形變量：75%。記錄各質(zhì)構(gòu)特性指標。其中凝膠強度（g·mm）=破裂力（g）×破裂位移（mm）。

1.3.4 色差的測定 用全自動色差儀對樣品進行測定，分別記錄L*、a*、b*值，用下式計算白度值，每個樣品平行測定3 次。

1.3.5 持水力的測定 參考Cando 等[26]方法并適當(dāng)修改，取重組魚肉約2 g 切成小塊，然后用3層濾紙包裹，放入離心管中，離心（4 ℃、3 000×g、10 min）。每個樣品平行測定3 次。

1.3.6 體外模擬消化模型 參考Van 等[27]、胡呂霖等[28]模擬消化液配制方法并適當(dāng)修改，具體如表1所示。稱取5 g 重組魚肉，加入15 mL 模擬胃液（pH 2.0±0.2，含胃蛋白酶），37 ℃恒溫振蕩器消化1 h；再加入15 mL 模擬腸液（pH 8.0±0.2，含胰蛋白酶），37 ℃恒溫振蕩器消化2 h。消化結(jié)束后100 ℃水浴5 min，待冷卻后加入15 mL 無水乙醇，4 ℃冰箱冷藏過夜后，8 000×g 離心20 min，分別留取胃消化后及經(jīng)過整個消化過程的上清液和沉淀，存于-80 ℃超低溫冰箱待用，每個樣品重復(fù)3次消化試驗。

表1 模擬消化液（唾液、胃液、腸液）成分Table 1 Compositions of digestive juices used for in vitro digestion

1.3.7 消化率測定

1.3.7.1 干物質(zhì)消化率 參考Fang 等[29]的方法并適當(dāng)修改，分別稱取1 g 消化前的樣品和1 g 消化后的樣品，于105 ℃烘箱，烘至恒重，稱量，干物質(zhì)消化率計算公式如下：

式中：W0——消化前的干物質(zhì)含量，g；W1——消化后的干物質(zhì)含量，g。

1.3.7.2 蛋白質(zhì)消化率 參考韋婕妤等[30]的方法并適當(dāng)修改，取消化前和消化后樣品各5 g 左右，于烘箱50 ℃烘至恒重。分別取消化前烘干樣品和消化后烘干樣品進行凱氏定氮。蛋白質(zhì)消化率計算方程如下所示：

式中：DT——蛋白質(zhì)體外消化率，%；W0——消化沉淀中蛋白質(zhì)的含量，g；W1——消化前重組魚肉中蛋白質(zhì)的含量，g。

1.3.7.3 BCA 蛋白濃度 用BCA 試劑盒測定消化后上清液中蛋白質(zhì)濃度。以全蛋白提取液在562 nm 下吸光度為空白對照。參考李黎[31]的方法并適當(dāng)修改，標準曲線配制如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用One-way ANOVA 進行方差分析和顯著性檢驗，由P＜0.05 判定存在顯著差異。作圖使用origin 8.5 軟件。

表2 稀釋蛋白濃度標準曲線Table 2 Preparation of diluted albumin（BSA）standards

2 結(jié)果與討論

2.1 肌原纖維蛋白的羰基與總巰基變化

由圖1 可知，羰基含量與氧化時間呈正相關(guān)（P<0.05），總巰基含量與氧化時間呈負相關(guān)（P<0.05）。羰基含量作為判定蛋白質(zhì)氧化的主要指標，隨著氧化時間的延長其含量上升，主要因為羥自由基與氨基酸側(cè)鏈或肽鏈不斷發(fā)生氧化[32]，這與朱文慧等[33]研究結(jié)果一致?？値€基含量也常常被認為是判定蛋白質(zhì)氧化程度的一個指標，蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基以游離巰基形式或氧化的胱氨酸形式存在，當(dāng)樣品置于氧化體系時，導(dǎo)致總巰基含量下降[34]。由圖1 還可知，試驗組羰基含量明顯低于對照組，試驗組的總巰基含量明顯高于對照組，這表明加入TGase 會加速蛋白質(zhì)的氧化，可能是因為加入TGase 導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，從而改變了鐵離子的結(jié)合位點，從而使鐵離子和過氧化物靠近，并引發(fā)氧化[35]，這與Moreno 等[7]研究結(jié)果一致。

圖1 羰基和總巰基含量的變化Fig.1 Change in carbonyl and total sulfhydryl content

2.2 蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表3 可知，隨著氧化時間的延長，硬度、彈性、咀嚼性、膠黏性、凝膠強度均下降。硬度、彈性、咀嚼性的降低，可能是因為氧化引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間構(gòu)象發(fā)生改變[36]；膠黏性、凝膠強度的降低，可能是因為蛋白質(zhì)在氧化過程中發(fā)生了去折疊反應(yīng)，導(dǎo)致其三維結(jié)構(gòu)發(fā)生破裂，也可能是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵遭到破壞[34]，從而使膠黏性和凝膠強度降低。且試驗組的各項指標值均高于對照組，這可能是因為加入TGase 可促進蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，有利于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[37]。這與婁忠緯[38]研究結(jié)果一致。有報道指出，存在TGase 的情況下蛋白質(zhì)氧化時凝膠特性會下降[7]，對比表3 可知，試驗組中凝膠強度下降幅度更大。

表3 蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 3 Effect of protein oxidation on textural properties of restructured minced grass carp

2.3 蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉色澤的影響

由表4 可知，隨著氧化時間的延長色度值L*、a*、W均下降。蛋白質(zhì)的白度可以間接反映蛋白質(zhì)變性情況，蛋白質(zhì)的氨基酸可能會與其氧化產(chǎn)物相互作用，從而導(dǎo)致其白度值下降[17]。Nyaisaba等[39]研究發(fā)現(xiàn)鱈魚魚糜凝膠的白度會隨氧化程度的增加而下降，本試驗研究結(jié)果與其一致。由表4還可知，試驗組的白度比對照組高，這可能是因為TGase 的加入影響凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，使其孔隙更小、更均勻，不透明性增加，光吸收能力降低，從而有較高的白度[40]。這與何芳[37]研究結(jié)果一致。

表4 蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉色差的影響Table 4 Effect of protein oxidation on color changes of restructured minced grass carp

2.4 蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉持水力的影響

持水率作為評價凝膠制品優(yōu)劣的重要指標，持水率越高表明凝膠保持內(nèi)部游離水分的能力就越強[41]。由圖2 可知，隨著氧化時間的延長，對照組和試驗組的持水率均下降，氧化1 h 時持水率顯著降低（P<0.05）；這可能是因為蛋白質(zhì)原有的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，分子間發(fā)生解聚，持水率下降。這與李學(xué)鵬等[5]研究結(jié)果一致。由圖2 還可知，試驗組的持水率比對照組高，可能是因為添加TGase 促進蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)，從而形成更穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[42]，這與Chanarat 等[25]研究結(jié)果一致。

圖2 蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉持水性的影響Fig.2 Effect of protein oxidation on water-holding capacity of restructured minced grass carp

2.5 蛋白質(zhì)氧化對體外消化率的影響

食物的生物利用度通常通過胃蛋白酶的消化率來評估，即胃蛋白酶分解后的干物質(zhì)分解的容易程度和顆粒大小。由于蛋白質(zhì)在穿過小腸壁進入血液之前必須分解成氨基酸或小肽，因此肉類和肉類產(chǎn)品的營養(yǎng)質(zhì)量在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的消化率[43]。蛋白質(zhì)氧化可能會通過改變蛋白質(zhì)疏水性、聚集性和二級結(jié)構(gòu)來改變體外消化率[44]。由表5 可知，在胃消化和腸消化過程中，對照組和試驗組的干物質(zhì)消化率、蛋白質(zhì)消化率、BCA 蛋白濃度均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能是因為前期氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而暴露出更多消化酶的作用位點，但隨著氧化時間的延續(xù)，蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間不斷聚集，從而掩藏了消化酶的作用位點，蛋白質(zhì)消化率降低[42]。這與姜晴晴等[18]研究結(jié)果一致。同時，胃蛋白酶和胰蛋白酶都有其特定的作用位點，當(dāng)作用位點附近的氨基酸被氧化時，蛋白質(zhì)消化率也下降[43]。由表5 還可知，試驗組樣品消化率均低于對照組，這可能是因為加入TGase 促進蛋白質(zhì)分子的聚集，蛋白質(zhì)被不同程度的修飾，TGase 形成的異肽鍵對水解酶具有抵抗力，且加入TGase 會促進蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的氧化，從而使蛋白質(zhì)消化率較低[35]。

表5 蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉體外消化率的影響Table 5 Effect of protein oxidation on in vitro simulated digestion of restructured minced grass carp

3 結(jié)論

本試驗研究了蛋白質(zhì)氧化和TGase 對草魚重組魚肉品質(zhì)及體外模擬消化的影響，結(jié)果表明重組魚肉肌原纖維蛋白羰基含量與氧化時間成正比，總巰基含量與氧化時間成反比，且加入TGase會加速其氧化。隨著氧化時間的延續(xù)，重組魚肉品質(zhì)發(fā)生劣變，硬度、彈性、咀嚼性、膠黏性、凝膠強度、L*值（亮度）、a*值（紅度）、W值（白度）和持水性均降低。蛋白質(zhì)氧化也會導(dǎo)致重組魚肉消化性發(fā)生改變，氧化前1 h 各消化率均上升，隨著氧化時間的延長而下降，雖然適當(dāng)?shù)难趸梢蕴岣呦?，但蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致食物營養(yǎng)成分的流失，因此實際加工生產(chǎn)中蛋白質(zhì)氧化對重組魚肉品質(zhì)的影響還需要進行深入研究，以期為草魚綜合利用提供理論支持。