王高敏， 吳 越， 王 霞， 陳夫山， 吉 喆

(青島科技大學 海洋科學與生物工程學院， 山東 青島 266042)

芹菜是一種具有藥用價值的兩年生傘形科草本植物，廣泛種植于歐洲、亞洲、非洲等地，在我國也有著悠久的栽培歷史[1]。芹菜中含有豐富的黃酮類化合物，這些物質既可以為芹菜提供防御機制，保護芹菜免受不同生物威脅和非生物威脅[2]，也可以充當信號素分子、植物抗毒素、排毒劑等，還具有抗菌防御、防霜凍和抗干旱的功能[3]。目前，芹菜中的黃酮類化合物已經被提取出來應用于保健食品、醫(yī)療健康等領域，且被證明具有抗氧化[4]、保護肝臟[5]、抗糖尿病[6]等功能。其中，芹菜素是芹菜中最主要的黃酮類化合物，主要以黃色素的形式存在于植物體內[7]，是黃酮類化合物中藥性和生物活性最強的化合物之一，有抗癌、抗氧化、抗炎[8-9]、抗過敏、抗抑郁、保肝、抗血栓形成和抗衰老的功效[10]。

索氏提取法、熱回流法和浸漬法是目前應用最廣的提取方法，但是這些方法耗時長、耗能大、所用溶劑量大，限制了其應用與發(fā)展[11]；膜分離技術可以依據膜的選擇透過性以及目標物分子量的差異在壓力推動下將目標物質分離、純化和濃縮[12]，但是對于分子量相接近、結構相似的目標化合物的分離效果較差。近年來，大孔樹脂純化技術[13-14]、聚酰胺樹脂純化技術[15-17]、葡萄糖凝膠樹脂純化技術[18-19]、制備型高效液相色譜技術[20-24]可以將黃酮類化合物進行準確分離，獲得高純度單體化合物，但這些提取純化方法耗時長、效率低，不能用于大規(guī)模生產。因此，為實現(xiàn)芹菜的低成本高值化利用，開發(fā)一種高得率、高純度的提取方法至關重要。

超臨界流體萃取(SFE)是一種從植物中提取和純化各種生物分子的有效技術，是傳統(tǒng)萃取技術(如溶劑萃取法、液相蒸餾法)的有效替代方法。超臨界流體是介于氣體和液體之間的流體，兼有氣體液體的雙重性質：一方面，其溶質的傳質阻力小，可以實現(xiàn)活性物質的快速高效分離[25]；另一方面，又具有較高的溶解能力，可在較低溫度下分離難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差和相對分子質量大的物質。CO2具有無色、無味、無毒、價廉、易獲取、溶解性好等又優(yōu)點，是目前應用最為廣泛的超臨界流體之一。然而，CO2是非極性物質，對極性和強極性物質的溶解能力較差。因此，需要向SFE體系中加入極性夾帶劑以提高溶質的溶解度和選擇性，從而增加產品收率[26-28]。SFE利用CO2和夾帶劑形成的流動相，在強度、壓力、溫度、固定相種類等多種因素的協(xié)同下，在結構類似物、同分異構體、對映異構體和非對映異構體混合物的分離純化中顯示出獨特的優(yōu)勢[29-30]。由于乙醇的溶解性能較好，對植物細胞的穿透能力較強，通常采用乙醇為夾帶劑提高對黃酮類弱極性物質的萃取能力。因此，本研究采用超臨界CO2流體和不同濃度的乙醇夾帶劑協(xié)同萃取芹菜中的芹菜素，并采用高效液相色譜法進行定量表征，以確定最佳的芹菜素萃取工藝條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

芹菜素標準品(98.0%，HPLC級)，購自上海阿拉丁生物科技有限公司；芹菜(Petroselinumcrispum)，系青島平度市馬家溝芹菜基地生產；無水乙醇(95%)，景明化工股份有限公司；無水乙醇(99%)，景明化工股份有限公司；乙酸(99.7%)，友和貿易股份有限公司；甲醇(100%)，友和貿易股份有限公司。

超臨界萃取設備，中國臺灣金屬工業(yè)研究中心；高效液相色譜儀，日本Hitachi公司:Pump,L-2130,Autosampler,L-2200,UV Detector,L-2400)；超聲波清洗器，F(xiàn)RQ-1004SHT型，杭州法蘭特超聲波有限公司；冷凍離心機，H5-21Kr型,湖南湘儀公司；電子天平,FA214型,上海豪晟公司。

1.2 實驗條件

1.2.1 標準溶液的配制

取芹菜素標準品20,50,100,200,400 μg，用50%乙醇溶解并定容至10 mL，得到終濃度為2，5，10，20，40 μg·mL-1的標準溶液。

1.2.2 超臨界萃取條件優(yōu)化

取250 g馬家溝芹菜粉末(顆粒大小在0.125 mm左右)，置于萃取槽中，在30 MPa、40 ℃的條件下進行萃取，每30 min從分離槽中取樣一次，分離槽溫度設定為50 ℃，壓力設定為4.5 MPa，持續(xù)萃取4 h。本研究主要探討夾帶劑對萃取結果的影響，已有學者提出，夾帶劑濃度的提高有利于非極性物質的萃取[31]，因此本實驗設計一組不添加夾帶劑的萃取試驗(SFE CO2)，一組添加95%濃度乙醇夾帶劑的萃取試驗(SFE CO2+95%EtOH)，一組添加99%濃度乙醇夾帶劑的萃取試驗(SFE CO2+99%EtOH)。本實驗采用萃取槽體積為1 L(10.5 cm×11.1 cm)的萃取設備，以50 g·min-1的CO2流速進行萃取，為避免堵塞，在萃取過程中同時從萃取槽出口端泵入流速為3.2 mL·min-1的乙醇溶液。當使用夾帶劑時，以3.2 mL·min-1流速泵入乙醇與CO2在萃取槽入口端前預先混合再加熱，然后進入萃取槽。

1.2.3 高效液相色譜測定芹菜素的含量

采用1.2.2的方法對芹菜素進行萃取，所得芹菜粗萃物以及芹菜素標準品用HPLC分析目標組分含量。分析方法：色譜柱：Kromasil 100-5-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相按表1梯度進行洗脫，分析波長設定為343 nm，柱溫40 ℃，流速為1 mL·min-1，進樣量為20 μL。

表1 流動相洗脫程序Table 1 Mobile phase gradident elution program

1.2.4 提取率計算公式

本研究中芹菜粉原料在試驗前均經過干燥預處理，故芹菜素提取率為高效液相色譜分析出芹菜素質量占原料投料量的質量分數(shù)。提取產物提取率的計算按照如下公式(1)進行。

(1)

式(1)中:F—提取率(質量分數(shù));

m—提取出產物的質量，g；

m0—原料投料量，g。

2 結果與討論

2.1 芹菜素標準品的色譜圖及標準曲線

芹菜素標準品的HPLC色譜圖保留時間為45 min。依照1.2.3節(jié)的分析條件進行測定，不同濃度芹菜素標準溶液的HPLC色譜圖如圖1所示。繪制標準曲線并得回歸方程為Y=0.065 1X(R2=0.997 5)。

圖1 芹菜素標準品不同濃度梯度芹菜素標準品HPLC色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of apigenin standards

2.2 添加不同濃度乙醇為夾帶劑的超臨界萃取結果

將添加不同濃度乙醇為夾帶劑進行超臨界萃取得到的樣品按照1.2.3的方法分析，得到的各個時間段的色譜如圖2所示。從圖2可以看出，3者色譜圖的信號峰數(shù)量與峰形極其相似，說明在這3種條件下所得到的產物基本一致。然而，不同濃度乙醇得到的產物的紫外吸收信號強度有明顯差異，這說明不同條件下超臨界萃取得到的芹菜素產率不同。為了分析不同萃取條件下芹菜素的產率以及在整個萃取過程中芹菜素萃取效率的變化，本研究依據外標法對萃取出的粗萃物中的芹菜素進行定量，結果如表2所示。

圖2 添加不同夾帶劑濃度超臨界萃取芹菜素色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of apigenin at different time periods in the process of different ethanol concentration

表2 僅使用CO2超臨界萃取過程中芹菜素含量Table 2 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2

由表2可知，在僅使用CO2進行萃取時，前90 min僅有少量的芹菜素被萃取出來，HPLC幾乎檢測不到信號，這是因為CO2溶劑是非極性溶劑，僅使用CO2難以溶劑黃酮類等極性物質。在120 min時開始有芹菜素的信號被檢出，且此時芹菜素的萃取效率最高。當萃取時間超過120 min后，芹菜素的響應值逐漸減弱，萃取得到的芹菜素質量逐漸減少。經定量分析，在僅使用CO2進行超臨界萃取時，芹菜素的萃取率僅為0.000 6%。

使用CO2和99%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量見表3。添加95%乙醇為夾帶劑萃取得到的樣品，其紫外吸收信號明顯高于不添加乙醇的樣品，這說明添加乙醇會更有效地萃取出芹菜素。在萃取過程前30 min萃取效率最高，120 min時芹菜素幾乎完全被萃取出來。在使用95%濃度的乙醇為夾帶劑與CO2共同進行超臨界萃取的過程中，芹菜素的萃取率升高至0.006%。

表3 使用CO2和95%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量Table 3 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2+95%EtOH

使用CO2和99%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量見表4。由表4可見，以99%濃度乙醇為夾帶劑所萃取出的芹菜素含量低于95%濃度的乙醇，推測造成該現(xiàn)象的原因可能是增加乙醇濃度使得原料的濕度增加造成原料結塊，不利于溶質分子與溶劑分子間的傳質，降低了萃取率。在整個萃取過程中，前30 min萃取效率最高，120 min時芹菜素幾乎完全被萃取出來。在使用99%濃度的乙醇為夾帶劑與CO2共同進行超臨界萃取的過程中，芹菜素的萃取率降至0.005%。

表4 使用CO2和99%乙醇共同萃取過程中芹菜素含量Table 4 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2+99%EtOH

2.3 萃取過程分析

超臨界流體萃取過程中芹菜素含量變化曲線見圖3。如圖3所示，在僅使用CO2而不加入其他夾帶劑萃取芹菜素時，萃取效果最差，且其在前90 min內幾乎檢測不到明顯的芹菜素信號；在添加乙醇夾帶劑與CO2共同進行超臨界萃取時，芹菜素的得率有明顯提高，這可能是因為芹菜素更易溶于極性溶劑。在使用夾帶劑輔助提取的過程中，濃度為95%的乙醇的提取效率要高于濃度為99%的乙醇，這說明適當濃度的乙醇可以降低限制超臨界流體萃取芹菜根中芹菜素的因素，但當濃度過高時也會降低傳質效率從而抑制芹菜素的萃取。

圖3 超臨界流體萃取過程中芹菜素的含量變化曲線Fig.3 Apigenin mass curve in supercritical fluid extraction

在整個萃取過程中，前120 min萃取效率較高，約90%的芹菜素在這個時間段被萃取出來，隨著萃取時間延長至150 min，芹菜素已經基本被萃取完全，該結果對工業(yè)生產有非常重要的意義。

3 結 論

1)比較在未添加夾帶劑萃取、添加95%乙醇輔助萃取、添加99%乙醇輔助萃取這3種情況下使用超臨界設備萃取出的粗萃物，發(fā)現(xiàn)添加乙醇為夾帶劑時萃取率遠遠高于僅使用CO2萃取的萃取率，這可能是由于芹菜素更易溶于極性溶劑。

2)在使用夾帶劑進行萃取時，濃度為95%的乙醇的萃取率要高于濃度99%的乙醇，萃取率為0.006%，這說明適當濃度的乙醇可以降低限制超臨界流體萃取芹菜根中芹菜素的因素，但乙醇濃度過高也會抑制芹菜素的萃取。

3)在整個萃取過程中，前120 min萃取效率最高，約有90%的芹菜素被萃取出來，這對工業(yè)生產具有重要意義。當萃取時間持續(xù)到150 min時，芹菜素基本萃取完全。