贠張君，王慧靜，孫梓宜，劉鑫源，姚樹坤

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的彌漫性非特異性炎性疾病，持續(xù)影響直腸近端的結(jié)腸黏膜并經(jīng)常形成糜爛和或潰瘍[1]，屬炎癥性腸病（IBD）的一種。據(jù)報道，在過去的20年中，由于生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的西方化，我國UC的發(fā)病率和患病率逐年攀升并呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。UC的發(fā)病有顯著的種族和地域差異，發(fā)病率和患病率最高區(qū)域主要集中于北歐，而在我國近20年來患病率有上升趨勢[3]。有學(xué)者[4]通過統(tǒng)計1981—2000年國內(nèi)報道的10 218例UC患者，發(fā)現(xiàn)近10年患病人數(shù)增加了3.08倍。因UC病程長、易復(fù)發(fā)、難治愈、大大降低患者生活質(zhì)量等特點，世界衛(wèi)生組織將其列為難治愈性疾病。雖然對其發(fā)病機(jī)理已有一定認(rèn)識，但其病因尚不明確，目前大多認(rèn)為與遺傳、感染、環(huán)境因素和腸黏膜免疫有關(guān)[5]。常規(guī)治療手段主要為水楊酸制劑、皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑一類抑制促炎反應(yīng)來緩解病情，但病情易反復(fù)，不良反應(yīng)明顯，如骨質(zhì)疏松癥、肥胖、胰島素抵抗、癌癥和結(jié)核病風(fēng)險增加[6-7]。因此，尋找UC的替代性治療藥物已成為一種研究趨勢。

以整體觀念和辨證論治為特點的中醫(yī)學(xué)在診治慢性難治性疾病方面具有一定優(yōu)勢。根據(jù)其臨床特點，中醫(yī)學(xué)將 UC 歸于“泄瀉”“腸風(fēng)”“臟毒”等范疇[8]，病因主要為先天稟賦不足、素體脾虛、飲食不節(jié)、情志失調(diào)等。大腸濕熱證、脾虛濕蘊證、寒熱錯雜證、肝郁脾虛證為主要證型[9]。近年來，隨著國民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的西方化，進(jìn)食過多的辛辣、油炸、燒烤等刺激性食物導(dǎo)致濕熱體質(zhì)盛行，現(xiàn)代疾病證候以實證、熱證居多，虛證、寒證較少，病證常常虛實夾雜，寒熱錯雜。結(jié)合查找研究文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大腸濕熱證為UC的中醫(yī)常見證候[10-11]。葛根芩連湯為治療身熱下利的經(jīng)典名方，方中葛根既能解表退熱，又可升脾胃清陽而止瀉，輔以黃芩、黃連清熱燥濕以厚腸止利。現(xiàn)多用于治療以濕熱蘊結(jié)大腸為基本病機(jī)的泄瀉，而UC早期多表現(xiàn)為黏液性膿血便。此外，已有大量研究顯示葛根芩連湯治療UC效果顯著，但對其作用機(jī)制研究較少或集中于單一通路，缺乏系統(tǒng)性分析。如秦凱健[12]等人通過系統(tǒng)性評價葛根芩連湯加減與柳氮磺吡啶治療381例UC患者，顯示聯(lián)合葛根芩連湯加減可提高治療總有效率；王浩、徐明[13]等人通過大鼠模型證明，葛根芩連湯可通過上調(diào)Bcl-2水平、下調(diào)Bax水平，保護(hù)結(jié)腸黏膜而治療UC；還有學(xué)者[14]表明葛根芩連湯可降低NO、IL-18的水平，促進(jìn)血漿SOD、IL-4的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化損傷、抗炎等作用治療UC。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是對疾病、蛋白靶標(biāo)、藥物的相互作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析，其系統(tǒng)生物學(xué)的理念與中醫(yī)學(xué)的整體觀念不謀而合[15-16]。其通過構(gòu)建藥物分子-靶點-疾病生物網(wǎng)絡(luò)，分析三者在網(wǎng)絡(luò)中的相互作用，探索作用機(jī)制[17]。本文將通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合GO富集分析和KEGG通路分析探討葛根芩連湯治療UC的多成分-多靶點-多信號通路特點，分子對接驗證其藥物活性，為UC的新藥研發(fā)及機(jī)制研究提供思路及方向。

1 材料與方法

1.1 葛根芩連湯有效成分及候選靶點篩選 葛根芩連湯組成中葛根、黃芩、黃連、甘草的有效化學(xué)成分通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[18]檢索。為了篩選出容易吸收、成藥的化學(xué)成分，根據(jù)毒藥物動力學(xué)ADME參數(shù)進(jìn)行篩選，篩選條件為OB（口服生物利用度）≥30%和DL（類藥性）≥0.18。其中OB是指藥物吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度和程度；DL指化合物與已知藥物的相似性。將篩選出來的化學(xué)成分導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫PharmMapper sever（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）中，通過反向藥效團(tuán)匹配技術(shù)預(yù)測化合物的候選靶點，物種類限定為人類。最后將上述靶點在 UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中標(biāo)準(zhǔn)化為基因名。

1.2 UC疾病相關(guān)靶點的檢索與篩選 通過藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫 DrugBank[19]（https：//www.drugbank.ca/）、靶點數(shù)據(jù)庫TTD[20]（http：//db.idrblab.net/ttd/）、基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫 DisGeNET[21]（https：//www.disgenet.org/）檢索UC相關(guān)靶點，刪除重復(fù)基因后，獲得UC疾病的相關(guān)靶點。

1.3 葛根芩連湯作用靶點的預(yù)測 應(yīng)用R VeenDiagram程序包對上述疾病與藥物靶標(biāo)取交集，獲得葛根芩連湯作用于UC的靶點蛋白。

1.4 蛋白互作（protein proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與拓?fù)浞治?將藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入STRING （https：//string-db.org/，Version11.0）[22]數(shù)據(jù)庫，Organism 設(shè)定為“Homo sapiens”，為了保證數(shù)據(jù)的高可信度，在“Settings”中設(shè)置分?jǐn)?shù)選擇為0.9，隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點，即可得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，并將上述文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件中進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.5 構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 將整理出的葛根芩連湯化學(xué)成分與UC相關(guān)的疾病靶點映射出共同靶點，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。其中節(jié)點（node）分別代表藥物、有效成分和潛在靶點，邊（edg）表明三者之間的關(guān)系。

1.6 分子對接驗證 PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）搜索藥物小分子2D結(jié)構(gòu)，應(yīng)用ChemBioOffice Ultra 2014 Wizard軟件優(yōu)化為3D結(jié)構(gòu)并統(tǒng)一保存為mol2格式。靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫中收集，使用PyMOL軟件去除水分子和配體分子，應(yīng)用AutoDockTools1.5.6對蛋白加氫、加電荷，使用命令提示符（CMD vina）進(jìn)行分子對接，最后利用PyMOL可視化處理。

1.7 GO富集分析與KEGG通路分析 將上述葛根芩連湯與UC交集靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（DAVID 6.8，https：//david.ncifcrf.gov/），物種限定為“人類”，進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析，篩選p<0.05的結(jié)果，導(dǎo)入R語言進(jìn)行氣泡圖制作，并檢索相關(guān)文獻(xiàn)，對主要通路進(jìn)行討論。

2 結(jié)果

2.1 藥物及疾病靶點獲取 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到146個有效化學(xué)成分，240個藥物靶點。其中，個別化學(xué)成分存在兩種藥物當(dāng)中，如芒柄花黃素（formononetin）存在于葛根、甘草中，β-谷甾醇（betasitosterol）存在于葛根、黃芩中；黃連堿（coptisine）存在于黃芩、黃連中；表小檗堿（epiberberine）存在于黃芩、黃連中；槲皮素（quercetin）存在于黃連、甘草中，反應(yīng)出葛根芩連湯多成分多靶點的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)。TTD、Drugbank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫共收集1 665個疾病靶點，標(biāo)準(zhǔn)化基因名并剔除重復(fù)值，最后得到1 382疾病靶點。

2.2 葛根芩連湯的潛在作用靶點 將獲得的藥物靶點與疾病靶點，通過R VeenDiagram程序包映射后，得到114個“藥物-疾病”共同基因，因此，葛根芩連湯可能通過114個交集基因的協(xié)同作用治療UC。詳見圖1。

圖1 藥物-疾病交集基因Venny圖

2.3 PPI核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓?fù)浞治?將114個基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫中，顯示114個節(jié)點（靶點蛋白）和354個邊緣（蛋白相互作用），平均節(jié)點度6.21，節(jié)點為蛋白，線條為蛋白間的相互作用關(guān)系，詳見圖2。應(yīng)用Cytoscape3.7.1軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，計?Degree、Betweenness、Closeness、Eigenvector、LAC值，篩選出高于每個條件中位值的基因，Degree值前10 的蛋白為 MAPK3、MAPK1、STAT3、FOS、MAPK14、ESR1、IL2、RELA、MYC、MAPK8，這些蛋白可能在葛根芩連湯治療UC發(fā)中發(fā)揮重要作用，見圖3。

圖2 葛根芩連湯治療UC的PPI網(wǎng)絡(luò)潛在靶點

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白

2.4 藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 通過Cytoscape3.7.1軟件建立藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖4，一個有效成分可作用于多種靶點，如來源于甘草、黃連的橡黃素（Quercetin）與84個靶點相連；多種活性成分可共同作用于一個靶點，例如靶點PTGS2、CALM1、HSP90AA1、ESR1、NOS2、PTGS1、PPARG、ESR2與60個以上有效成分連接，反應(yīng)出葛根芩連湯多成分、多靶點的協(xié)同作用。通過Cytoscape3.7.1分析后顯示出關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大的藥物化學(xué)成分有橡黃素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A等，上述成分可能為葛根芩連湯治療UC的重要活性成分。

圖4 藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.5 分子對接模擬驗證結(jié)果 將PPI核心網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前12的靶點作為蛋白受體，藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大的前6的化學(xué)成分：甘草查爾酮A（MOL000497）、槲黃素（MOL000098）、漢黃芩素 （MOL000173）、柚皮素（MOL004328）、 黃 芩 素 （MOL002714）、 山 柰 酚（MOL000422）作為小分子配體，使用匹配原則算法來預(yù)測其結(jié)合模式及親和力。以結(jié)合能作為篩選條件，配體與受體結(jié)合能量越低，代表相互作用關(guān)系越強(qiáng)烈，結(jié)合能≤-5.0 kcal/moL表示有較強(qiáng)親和力[23-24]。共得到25個對接結(jié)果，如表1所示，強(qiáng)親和力對接結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明潛在靶點與有效成分有較強(qiáng)的結(jié)合力。

圖5 核心靶點與活性成分對接模式

表1 核心靶點與活性成分結(jié)合能

2.6 GO功能富集分析 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對114個核心靶點進(jìn)行GO富集分析，共得到599條結(jié)果，并以P值進(jìn)行排序，篩選出P<0.05的生物學(xué)過程，運用R語言選取BP、CC、MF的前20繪制氣泡圖（圖6-圖8）。GO富集分析分為3類：生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）。其中以 BP條目最多，451個，主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、氧化還原反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、免疫反應(yīng)等方面；CC相關(guān)條目48條，主要分布于核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間等方面；MF相關(guān)條目100條，主要涉及蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)同型二聚體活性等方面。綜上，GO分析結(jié)果顯示葛根芩連湯可涉及炎癥、免疫、氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡、低氧反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)發(fā)揮治療作用。2.7 KEGG通路富集分析 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對114個核心靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，獲得117條結(jié)果。應(yīng)用R語言軟件富集出前20個KEGG通路（見圖9），如癌癥通路、磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K-Akt）信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、Toll受體（Toll-like receptor）及叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）信號通路、Ras信號通路等多個信號通路，表示葛根芩連湯通過多個信號通路協(xié)同發(fā)揮作用。

圖6 生物過程的富集分析氣泡圖

圖7 細(xì)胞組成的富集分析氣泡圖

圖8 分子功能的富集分析氣泡圖

圖9 KEGG通路的富集分析氣泡圖

3 討論

本研究共篩選出葛根芩連湯146個有效化學(xué)成分，240個藥物靶點，1 382疾病蛋白。首先，通過藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，顯示出關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較大的藥物化學(xué)成分有橡黃素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素、黃芩素、甘草查爾酮A等，上述成分為葛根芩連湯治療UC的重要活性成分。腸上皮細(xì)胞與免疫細(xì)胞構(gòu)成了腸道屏障，共同維持腸道微環(huán)境的穩(wěn)定。炎癥反應(yīng)和腸黏膜修復(fù)因子損傷介導(dǎo)了UC的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)顯示橡黃素[25]可通過上調(diào)Arg-1同時抑制IL-17A，促進(jìn)腸粘膜修復(fù)因子的表達(dá)而改善腸道炎癥狀態(tài)；而山柰酚具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用，其可通過阻滯細(xì)胞周期于G2/M期、作用于PI3K-Akt發(fā)揮效用[26-27]；柚皮素可下調(diào)總谷胱甘肽硫代肽（T-GSH）、非蛋白硫代肽（NP-SH），促進(jìn)腸上皮黏液分泌從而產(chǎn)生對炎癥性腸病的保護(hù)作用[28]。另有研究表明[29]，黃芩素干預(yù)的大鼠模型中，NF-κB和MAPK表達(dá)水平顯著降低，NF-κB與MAPK的激活可誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥瀑布；甘草查爾酮A[30]則可通過抑制NF-κB，提高Nrf2水平，降低氧化應(yīng)激和炎癥因子表達(dá)，從而緩解UC腸粘膜炎癥。因此，推測葛根芩連湯可通過抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)粘膜修復(fù)因子的表達(dá)來緩解UC的發(fā)生發(fā)展。其次，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示 PTGS2、CALM1、HSP90AA1、ESR1、NOS2、PTGS1、PPARG、ESR2與60個以上有效成分連接，這些可能是葛根芩連湯治療UC的關(guān)鍵靶點，其中ESR1[31]、PTGS2[32]、PPARG[32]、NOS2[33]已被學(xué)者證實是 UC 的重要靶點，但其他相關(guān)性極高的靶點CALM1、HSP90AA1等為本研究首次發(fā)現(xiàn)，這可為進(jìn)一步研究UC的作用機(jī)制提供新的參考方向。

GO富集分析結(jié)果顯示，葛根芩連湯活性成分主要富集在RNA聚合酶II、細(xì)胞增殖及凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、低氧反應(yīng)等生物學(xué)過程，其中炎癥及免疫反應(yīng)介導(dǎo)UC發(fā)生發(fā)展與大多數(shù)既往學(xué)者觀點一致。RNA聚合酶II與幽門螺旋桿菌感染誘導(dǎo)特異性基因的甲基化有關(guān)，而甲基化水平與黏膜癌變風(fēng)險相關(guān)[34]?！吧硇匀毖酢笔堑脱跛降哪c黏膜特征，是正常上皮細(xì)胞生理的原因和結(jié)果，而“病理性低氧”則是腸黏膜活動性炎癥的標(biāo)志[35]，HIF[36]是低氧反應(yīng)的主調(diào)節(jié)因子。正常微環(huán)境中，HIF-α可被蛋白酶降解，在缺氧狀態(tài)，HIF可上調(diào)VEGF、iNOS、EPO等多種靶基因，使機(jī)體適應(yīng)缺氧環(huán)境而緩解黏膜炎癥[37]。體內(nèi)重要的代謝途徑都需要氧氣的參與，組織病理性缺氧和局部炎癥反應(yīng)幾乎是同時發(fā)生的[38]。攜氧的炎癥細(xì)胞聚集黏附可導(dǎo)致局部氧耗盡誘發(fā)炎癥，而炎癥反應(yīng)致使微血管損傷，可進(jìn)一步加重局部組織的灌注不足而造成炎癥的惡性循環(huán)[39-41]。因此，葛根芩連湯可能通過改善腸黏膜局部氧供緩解腸粘膜炎癥，作用于RNA聚合酶II而降低黏膜癌變風(fēng)險。

KEGG通路富集分析顯示，主要涉及通路包括Cancer、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK、TOLL 受體等多個信號通路。UC患者癌變風(fēng)險與病程呈正相關(guān)，這與結(jié)直腸黏膜的長期慢性炎癥相關(guān)。癌變的發(fā)生源于“反復(fù)炎癥—不典型增生—癌變”三部曲，反復(fù)的炎癥和腸黏膜的損傷-修復(fù)，釀成了易于腫瘤生長的微環(huán)境[42]。研究表明，癌癥通路涵蓋了本文所提出的FoxO[43]、Ras-MAPK[43]、TOLL 受體[44]、HIF[45]等多個信號通路。研究表明，F(xiàn)oxO3可上調(diào)NF-κBp50損害腸黏膜屏障使炎癥持續(xù)存在增高癌變風(fēng)險[46]。Toll-like receptor 4通過調(diào)節(jié)ACA-T1抑制腸癌細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散，下調(diào)MAPK-HIF-α-VEGF途徑可抑制腫瘤血管生成，延緩腫瘤進(jìn)展[45]。這表明葛根芩連湯可能在延緩UC向大腸癌進(jìn)展過程中扮有重要角色。其次，TNF和TNFR超家族在介導(dǎo)細(xì)胞分化、生成、凋亡、炎癥、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮了重要作用[47]。其中，TNF-α是一種在腸黏膜固有層高度表達(dá)的促炎因子，在增加腸黏膜的通透性、造成局部的損傷和炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血栓形成等方面起有重要作用，并介導(dǎo)NF-κB、MAPK、Toll樣受體4等多個信號通路[48-50]。目前，TNF單抗已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療重度UC，并得到廣泛認(rèn)可，這與本文得到的TNF通路一致。另有學(xué)者表明，黃芩湯[51]通過抑制Ras-P13K-Akt-HIF-1α和NF-κB通路、調(diào)節(jié)TLR4和GPCR抑制Ras信號通路，從而下調(diào)炎癥因子，緩解腸黏膜炎癥。因此，我們推測，葛根芩連湯可能通過作用于Ras-P13K-Akt-HIF-1α、TLR4-Ras信號通路發(fā)揮抗炎、作用于MAPK-HIF-α-VEGF延緩腫瘤進(jìn)展等作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和既往研究基礎(chǔ)，揭示了葛根芩連湯治療UC的多成分、多靶點、多通路的網(wǎng)絡(luò)作用，主要與相關(guān)通路介導(dǎo)的抗炎、抗氧化損傷、低氧反應(yīng)、阻滯細(xì)胞周期延緩腫瘤進(jìn)展等效應(yīng)有關(guān)。目前多項研究表明中醫(yī)學(xué)的濕熱證與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的慢性炎癥高度一致，中醫(yī)學(xué)清熱祛濕法相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抗炎治療，這與本研究顯示葛根芩連湯作用于多個經(jīng)典炎癥通路相符。然而本研究不足之處在于，僅是對葛根芩連湯治療UC機(jī)制的理論層面探討，不能精確地闡述和證實上述通路在體內(nèi)的具體代謝機(jī)制，未來還需通過動物實驗進(jìn)一步驗證。