光照強度與瓊枝藻生長、光合色素和顏色值的相關性分析

童立豪，吳翔宇，黃良夫，曾 俊，石耀華，唐賢明

（1. 海南省海洋與漁業(yè)科學院/海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術重點實驗室，海南 ?？?571126； 2. 廣西科學院廣西紅樹林研究中心/廣西紅樹林保護與利用重點實驗室，廣西 北海 536007； 3. 海南大學海洋學院，海南 海口 570228）

瓊枝藻 (Betaphycus gelatinae) 隸屬于紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、紅翎菜科、瓊枝藻屬，俗稱瓊枝麒麟菜，主要分布于中國、菲律賓、日本、印度尼西亞等地，在中國自然分布于海南島、東沙群島和臺灣島等熱帶和亞熱帶海區(qū)[1-4]。自然界中瓊枝藻主要附著在近岸巖礁、珊瑚礁等基質上生長，藻體背、腹面顏色差異明顯，分別呈紫紅色和黃綠色，枝扁平，分枝上有疣狀突起。

作為中國海南特有土著海藻種類，瓊枝藻具有重要的生態(tài)價值及較高的經濟價值，被廣泛應用于食品加工、卡拉膠提取等領域[5-7]。研究表明，瓊枝藻藻體所含生物活性物質具有廣譜病毒抑制[8-9]、抗凝血和抗血栓[8,10]、抗真菌[11]、抗炎癥和抗腫瘤[12]等功效，可作為醫(yī)藥開發(fā)的良好材料。

當前瓊枝藻野生資源極盡枯竭，呈現(xiàn)顯著萎縮的趨勢[13]，而人工養(yǎng)殖是解決原材料來源的主要途徑[14]。數(shù)據顯示，近年來瓊枝藻養(yǎng)殖產量持續(xù)下降，2018年僅 1 820 t，比 2017年 (5 629 t) 減少67.67%[15]，這與海洋生態(tài)壞境破壞、海域使用空間減少以及研究基礎薄弱等因素有關。我國早在1960年就開始了瓊枝藻栽培研究，建立了較為成熟的養(yǎng)殖模式和種植技術[16]，但目前有關瓊枝藻的研究仍較少，僅有營養(yǎng)成分[6]、卡拉膠提取[7]、藥用價值[17]、環(huán)境因子對其生長的影響[14,16,18-19]等少量報道。因此，開展相關的基礎研究，支撐和服務于養(yǎng)殖產業(yè)發(fā)展顯得尤為重要。

光是影響植物生長發(fā)育、生理生化和形態(tài)建成等方面的重要影響因子，大型海藻在長期的自然進化過程中，形成了不同的光適應機制，不同種海藻對光照強度的需求不同。如石花菜 (Gelidium amansii)幼孢子體的適宜生長光照強度為 2 200～4 400 lx[20]；條斑紫菜 (Porphyra yezoensis) 的適宜生長光照強度為 6 600 lx[21]；瓦氏馬尾藻 (Sargassum vachellianum)的適宜生長光照強度為 1 100 lx[22]。方哲等[18]以鹵鎢燈為光源研究了光照強度與瓊枝藻生長的關系，認為瓊枝藻在光照強度為3 000 lx時日生長率最高。童立豪等[23]研究了光質對瓊枝藻生長和生理特性的影響，認為紫光和藍光更有利于瓊枝藻的生長。本文在前期工作的基礎上，通過CSE-1成像色度檢測分析系統(tǒng)，對光照強度與瓊枝藻生長等生理指標的相關性進行了量化分析和探討，以期為瓊枝藻生物學研究及人工種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

瓊枝藻取自海南省海洋與漁業(yè)科學院瓊?？蒲谢?(110°40'07.2''E、19°21'58.2''N)，挑選顏色正常、生長旺盛的藻體洗凈，于自然海水中暫養(yǎng)7 d后開始實驗。暫養(yǎng)溫度28 ℃，鹽度28，光照強度5 000 lx，光周期為 12 L∶12 D。

1.2 實驗設置

挑選健康無潰爛的瓊枝藻 2～3 g (濕質量) 培養(yǎng)于 1 L 玻璃燒杯中。設置 1 000、3 000、5 000、7 000和 9 000 lx 共 5個光照強度，每個光照強度設置3個重復；采用多排密集日光燈管提供光照，通過距離遠近調節(jié)光照強度。溫度、鹽度和光周期與暫養(yǎng)條件相同。每7 d換1次海水并稱質量，實驗持續(xù) 35 d。

1.3 生長速率和增重率計算

每7 d測量瓊枝藻的濕質量，稱量前用吸水紙快速吸干藻體表層水。根據以下公式計算增重率(Weight gain rate, WGR, %) 和相對生長速率 (Relative growth rate, RGR, %·d?1)：

式中：t為培養(yǎng)時間 (d)；M0為初始濕質量(g)；Mt為 t天后的濕質量 (g)。

1.4 色素和藻膽蛋白的提取和分析

實驗第35天提取和分析藻體色素和藻膽蛋白質量分數(shù)。

葉綠素 a (Chl-a) 和類胡蘿卜素 (Car) 采用無水甲醇提取法測定。根據Porra[24]的公式計算Chl-a的質量分數(shù)；根據Parsons等[25]的公式計算Car的質量分數(shù)。

藻紅蛋白 (PE) 和藻藍蛋白 (PC) 采用磷酸緩沖液提取法測定。根據Beer和Eshel[26]的公式計算PE和PC的質量分數(shù)。

1.5 顏色參數(shù)的測量與計算

實驗第35天，用相機 (佳能EOS6D，日本) 對藻體進行無差別圖片采集，后將待測圖片導入CSE-1成像色度檢測分析系統(tǒng)中，隨機選取5個點，獲得其相應的顏色參數(shù) L*a*b*(CIE 1976) 和三刺激值 XYZ (CIE 1931) (L*為明度，數(shù)值介于0～100，a*指紅綠色度，+ a*為紅，– a*為綠；b*指黃藍色度，+ b*為黃，– b*為藍；X、Y、Z 分別指紅、綠、藍三原色值，表示顏色的光色度特性)。計算各處理組L*a*b*和XYZ的平均值，分別作為該藻體顏色參數(shù)和三刺激值，根據下列公式計算色品坐標x、y以及不同光照強度間藻體色差?Eab：

1.6 統(tǒng)計分析

利用 Excel 2019和 SPSS 18.0軟件進行數(shù)據處理及統(tǒng)計分析。采用One-way ANOVA (Turkey)和t檢驗分析顯著性差異 (P<0.05)。光照強度、RGR、Chl-a、Car、PE、PC與L*a*b*之間采用Pearson相關性分析 (顯著水平為P<0.05)。

2 結果

2.1 光照強度對瓊枝藻生長的影響

光照強度為 1 000～9 000 lx 時，瓊枝藻的RGR總體上隨光照強度的增加而增大。光照強度為 1 000 lx時，瓊枝藻的 RGR 僅為 (0.12±0.01) %·d?1，遠低于其他光照強度組；光照強度為7 000與9 000 lx時，RGR 達到最大 (約 1.2 %·d?1) 且無顯著差異 (P>0.05，圖 1)。

圖1 不同光照強度對瓊枝藻相對生長速率的影響不同小寫字母間表示差異顯著 (P<0.05)。Figure 1 Effects of different light intensities on RGR of B. gelatinaeDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

光照強度為1 000 lx時，瓊枝藻的WGR在實驗期間無明顯增加；其余各處理組生長變化趨勢基本一致，實驗前14 d生長較緩慢，第14—21天增長較明顯，之后趨于穩(wěn)定，WGR均隨時間的延長逐漸上升。光照強度 7 000和 9 000 lx組的增重率變化曲線基本重合 (圖2)。

圖2 不同光照強度下瓊枝藻增重率隨時間的變化Figure 2 Change of WGR for B. gelatinae at different light intensities along with time

2.2 光照強度對瓊枝藻光合色素質量分數(shù)的影響

隨著光照強度的增加，瓊枝藻的Chl-a質量分數(shù)逐漸下降。光照強度 1 000和 3 000 lx組的 Chl-a質量分數(shù)顯著高于 9 000 lx 組 (P<0.05)，其余處理組間無顯著差異 (P>0.05)。光照強度 9 000 lx 組的Car質量分數(shù)顯著低于 3 000 lx 組 (P<0.05)，其余處理組間無顯著差異 (P>0.05)，且 1 000、5 000和 7 000 lx組的 Car質量分數(shù)基本一致 (圖 3)。

圖3 不同光照強度下瓊枝藻的色素質量分數(shù)不同小寫字母間表示差異顯著 (P<0.05)；不同大寫字母間表示差異顯著 (P<0.05)；圖4同此。Figure 3 Pigment mass fraction of B. gelatinae at different light intensitiesDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).Different capital letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in Figure 4.

光照強度為1 000 lx時，瓊枝藻的PE質量分數(shù)顯著高于其他處理組 (P<0.05)，且隨光照強度的增加逐漸下降，光照強度3 000 lx組的PE質量分數(shù)顯著高于 5 000、7 000和 9 000 lx 處理組 (P<0.05)，后3個處理組間均無顯著差異 (P>0.05)。各光照強度下的PC質量分數(shù)均較低，1 000 lx組較其他組高且差異顯著 (P<0.05，圖4)。

圖4 不同光照強度下瓊枝藻的藻膽蛋白質量分數(shù)Figure 4 Phycobiliprotein mass fraction of B. gelatinae at different light intensities

2.3 光照強度對瓊枝藻顏色的影響

實驗材料初始顏色均為紅褐色。經35 d實驗后，光照強度1 000 lx下瓊枝藻顏色未發(fā)生變化，仍呈紅褐色，與實驗前藻體顏色無明顯差異；光照強度3 000和5 000 lx下瓊枝藻顏色呈淺紅色，并逐漸偏向綠色；而光照強度7 000和9 000 lx下瓊枝藻的顏色無明顯差異，均為綠色 (圖5)。

圖5 不同光照強度下瓊枝藻的顏色變化Figure 5 Color change of B. gelatinae at different light intensities

本研究顯示，經35 d實驗后，顏色均一的瓊枝藻隨光照強度的增加L*和b*總體上呈增大趨勢，而a*則呈顯著減小趨勢 (表1)。L*介于26.14～50.64，光照強度為 9 000 lx時，L*最大；光照強度為 1 000 lx時，L*最小。a*介于?10.28～28.24，光照強度為 7 000和 9 000 lx時，色度均為綠色 (?a*)；其余光照強度下，色度為紅色 (+a*)。b*介于12.49～34.25，各處理組的色度均為黃色 (+b*)；光照強度為 1 000 lx 時b*最小，光照強度為 7 000 lx 時b*最大。

表1 不同光照強度下瓊枝藻的明度、紅綠色度和黃藍色度Table 1 L＊a＊b＊ values of B. gelatinae at different light intensities

不同光照強度下瓊枝藻顏色的三刺激值XYZ集中在CIE 1931色度圖上x為0.354～0.519、y為0.313～0.471。光照強度為1 000 lx時，主要分布在紅原色區(qū)域，偏暗紅色；光照強度為3 000和5 000 lx時分布在紅原色和綠原色過渡區(qū)，偏向黃色；光照強度為7 000和9 000 lx時則主要分布在綠原色區(qū)域，偏亮綠色 (圖6)。

圖6 不同光照強度下瓊枝藻的顏色色度圖分布Figure 6 Distribution of XYZ on CIE color diagram for B. gelatinum at different light intensities

不同光照強度下各處理組間瓊枝藻顏色的色差?Eab最小為11.22，最大為50.57，且隨光照強度差異的增大而增加 (表2)。

表2 不同光照強度下瓊枝藻顏色的色差?EabTable 2 ?Eab values of B. gelatinae at different light intensities

2.4 瓊枝藻顏色變化與光照強度、生長、光合色素的相關性

光照強度與L*呈顯著正相關 (R=0.922,P<0.05)，與a*呈極顯著負相關 (R=?0.997,P<0.01)。RGR 與L*呈顯著正相關 (R=0.933,P<0.05)，與b*呈極顯著正相關 (R=0.968，P<0.01)。Chl-a與L*呈顯著負相關 (R=?0.883,P<0.05)，但與a*呈顯著正相關 (R=0.952,P<0.05)；Car 與顏色參數(shù)L*a*b*均無顯著相關性。PE和PC均僅與a*呈顯著正相關 (P<0.05，表 3)。

表3 瓊枝藻的顏色參數(shù) (明度、紅綠色度、黃藍色度) 與光照強度、相對生長速率、光合色素的相關性Table 3 Correlation between L＊a＊b＊ values with light intensity, RGR and photosynthetic pigment

3 討論

3.1 瓊枝藻生長對光照強度的響應

植物通過光合作用合成有機物，滿足自身生長的能量需要，而光照強度直接影響植物的光合生長，在長期的進化過程中，不同植物對光照強度有著不同的適應機制[27-28]。光照強度過低時會導致光合作用不足，影響藻類植物的正常生長，過高則會導致藻體產生過多的單線態(tài)氧 (1O2)，破壞藻體的光合色素和光合組織結構，最終影響其正常生長[29-31]。研究發(fā)現(xiàn)，長心卡帕藻 (Kappaphycus alvarezii) 綠色品系和紅色品系對光照強度的需求差異明顯，最適生長光照強度分別為 8 300和 1 600 lx[32]；真江蘺 (Gracilaria verrucosa) 隨光照強度的增大生長速率逐漸增加，當光照強度為5 000 lx時生長速率最高[33]；芋根江蘺 (G. blodgettii) 的最適生長光照強度為9 000 lx[34]。本研究中瓊枝藻的生長速率隨光照強度的增加而增大，當光照強度達到5 000 lx后生長速率沒有顯著增加，表明瓊枝藻在5 000～9 000 lx光照強度下均能快速生長。方哲等[18]研究顯示光照強度為3 000 lx時，瓊枝藻的日生長速率最高。造成這種差異的原因，可能是由于實驗條件如材料處理、溫度、鹽度、光質等不同所致。方哲等[18]的研究用鹵鎢燈作為光源，而本研究以日光燈為光源，這也可能會影響同一光照強度下藻體的生長速率。

3.2 瓊枝藻光合色素質量分數(shù)對光照強度的響應

紅藻植物光合色素主要由Chl-a和藻膽蛋白組成，藻膽蛋白主要包括PE、PC和別藻藍蛋白[35]。Chl-a和藻膽蛋白是光合作用的反應中心和捕光系統(tǒng)，藻膽蛋白捕獲光能并傳遞給光系統(tǒng)Ⅱ，光能依次通過PE、PC、別藻藍蛋白傳遞至Chl-a[36]。Chl-a和藻膽蛋白受環(huán)境因子尤其是光照強度的影響，在一定范圍內，隨著光照強度的增加，Chl-a、藻膽蛋白的含量下降[37]。本研究符合這一規(guī)律，經35 d培養(yǎng)后瓊枝藻在低光照強度條件下Chl-a、類胡蘿卜素和藻膽蛋白質量分數(shù)較高，并隨著光照強度的增加而逐漸下降，這可能是瓊枝藻應對不同光照強度的一種自我調節(jié)，通過增加光合色素含量，使其在光照強度不足時提高光能利用率，盡可能地滿足自身生長對能量的需要。在方哲等[18]的研究中，Chl-a和藻膽蛋白含量總體變化與本研究相似，但其Chl-a含量顯著低于本研究，而藻膽蛋白尤其是PE含量卻遠高于本研究，這種差異可能是由實驗材料處理方法和實驗光源不同造成，也可能是提取方法不同所致。

3.3 光照強度對瓊枝藻顏色的影響及相關性分析

經35 d培養(yǎng)，肉眼觀察和三刺激值XYZ在CIE 1931色度圖中的散點圖分析均顯示，隨著光照強度的增加，瓊枝藻由紅原色經黃色而最終趨于綠原色，光照強度對藻體的顏色有顯著影響，與方哲等[18]的研究描述基本一致。本文采用顏色參數(shù)L*a*b*和CIE 1931色度圖分析，更精準地體現(xiàn)了顏色差異與光照強度的關系。相關性分析顯示，光照強度與L*呈顯著正相關，而與a*呈極顯著負相關；RGR與L*、b*均呈顯著正相關；藻體顏色參數(shù)變化與光照強度、RGR具有較強的相關性和規(guī)律性，可通過測定藻體的顏色參數(shù)值來分析和判斷藻體的生長狀況，具有一定的準確性和科學性。顏色是色素等呈色物質的種類、數(shù)量和分布的綜合體現(xiàn)，使植物顯現(xiàn)出不同顏色[38-39]，這既與物種的遺傳組成有關，也受光照等環(huán)境因子的影響[40]。瓊枝藻的色素和藻膽蛋白含量變化可能是其在不同光照強度下呈現(xiàn)出不同顏色的重要因素。本研究顯示，不同光照強度下瓊枝藻顏色參數(shù)L*a*b*與Chl-a以及藻膽蛋白質量分數(shù)顯著相關，表觀顏色的變化是瓊枝藻內部色素作用的結果，通過對藻體顏色參數(shù)分析，可對藻體內在色素的組成、含量等作出一定的判斷。