劉世欣 馮軍偉 董得平 王曉飛 尚海

摘要：為了能成功制備出抗氧化性更高的小麥肽，本課題應(yīng)用分布酶解方法，基于響應(yīng)面法完善擇堿性及風(fēng)味蛋白酶兩種酶的最佳酶解工藝參數(shù)，超濾技術(shù)分級(jí)分離最后獲得的酶解物。最后所得的酶解物自由基DPPH、O2-、·OH清除率分別75.37%、74.52%、76.28%。綜合分析，認(rèn)為小麥蛋白酶解物自身的抗氧化活性處于較高水平。

關(guān)鍵詞：小麥蛋白;雙酶酶解;小麥肽;抗氧化性

引言

有研究發(fā)現(xiàn)，小麥蛋白的蛋白質(zhì)含量達(dá)到75%-85%，麥醇溶蛋白、麥谷蛋白是其主要成分。因?yàn)樾←湹鞍鬃陨硖厥獾慕Y(jié)構(gòu)與氨基酸構(gòu)成，造成分子內(nèi)疏水區(qū)偏大，以致其在水內(nèi)的溶解性整體偏差。為全面提升其加工與功能屬性，既往多采用物理法、化學(xué)法及酶解法進(jìn)行。相比之下，蛋白質(zhì)酶解改性反應(yīng)過(guò)程平穩(wěn)、效率高、便于控制、產(chǎn)物可靠性較高。小麥肽作為酶解的主要產(chǎn)物之一，抗氧化性是其主要的功能屬性，自由基DPPH、O2-、·OH清除情況等均是反應(yīng)抗氧化性的常用指標(biāo)，本課題應(yīng)用了分步酶解方法，研究酶解制備小麥肽的抗氧化性。

1. 概念分析

1.1 小麥蛋白

蛋白質(zhì)占小麥總量的13%左右，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白等構(gòu)成，其中清蛋白主要存在于胚內(nèi)，其溶于水于稀鹽溶液，熱穩(wěn)定性偏低，溫度達(dá)60℃時(shí)可變性。球蛋白在小麥蛋白總量中占比6%-10%，溶于10%NaCI，但和水不相溶。麥醇溶谷蛋白占比約40%-50%，為小麥作物的主要蛋白，和水及中性鹽溶液均，但溶70%-90%乙醇。

1.2 小麥肽

這是一種始源于小麥蛋白的植物性生物活性肽，內(nèi)含人體必需的15種氨基酸，其具有水溶性好、容易吸收、生物活性強(qiáng)等諸多特點(diǎn)。既往已經(jīng)有研究證實(shí)，人體攝入的蛋白質(zhì)被自體消化系統(tǒng)內(nèi)的酶作用后，絕非是以氨基酸的形式被吸收，吸收形式以低肽為主。

2. 操作方法

（1）分步酶解：把100g小麥蛋白與定量去離子水相混合，放置在水浴鍋內(nèi)保溫，1.0mol/L NaOH將容易調(diào)整至設(shè)計(jì)pH值，隨后加入適量酶進(jìn)行酶解，以上過(guò)程中每間隔20min就調(diào)整1次pH值，使其維持恒定;充分?jǐn)嚢杳附?，酶解整體完成后，沸水持續(xù)滅酶10min，調(diào)整溫度與pH至到風(fēng)味蛋白酶的最適條件（溫度50℃、pH6.5）;添加定量風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行第2步酶解，pH調(diào)整、攪拌、滅酶操作同第1步;自然冷卻后2800r/min離心處理20min，提取上清液充分冷凍干燥，低溫（-20℃）環(huán)境下保存以備用。

（2）檢測(cè)自由基清除率：具體是參考HALLIWELL等研究中形成的方法測(cè)定1，1一二苯基一2一三硝基苯肼（DPPH）、超氧陰離（O2-、）、羥自由基（·OH）的清除率。

（3）設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)：①堿性蛋白酶：選出影響自由基清除率的主要因素，有底物濃度X1、酶濃度X2、反應(yīng)時(shí)間X3作為自變量;DPPH、O2-、·OH清除率（Y1、Y2、Y3）作為因變量。Rox-Behnken開展響應(yīng)面的優(yōu)化試驗(yàn)。②風(fēng)味蛋白酶：酶濃度X1、反應(yīng)時(shí)間X2是影響自由基清除率的主要因素，將其作為自變量;自由基清除率Y1、Y2、Y3作為因變量，在專業(yè)軟件的協(xié)助下開展響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

超濾分級(jí)分離：應(yīng)用截留分子量依次是5000、3000、10000u超濾膜分別對(duì)小麥混合肽進(jìn)行分級(jí)分離處理，獲得I、II、III、IV組分，均進(jìn)行冷凍干燥處理以備用。用以上四組分與混合肽試樣配制3mg/mL，測(cè)定DPPH、O2-、·OH清除率。

3. 統(tǒng)計(jì)與分析結(jié)果

3.1 堿性蛋白酶

3.1.1 酶解結(jié)果

當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)<10%時(shí)，伴隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，蛋白酶解物的DPPH、O2-、·OH清除率均呈提高趨勢(shì);質(zhì)量分?jǐn)?shù)恰好是10%時(shí)，以上三種自由基的清除能力均達(dá)到峰值，依次是56.32%、55.68%、58.45%;質(zhì)量分?jǐn)?shù)>10%時(shí)，三種自由基的清除能力均呈下滑趨勢(shì)。當(dāng)添加的酶和底物充分反應(yīng)后，再增加底物濃度使其處于飽和狀態(tài)，對(duì)底物與酶兩者的反應(yīng)起到一定抑制作用。綜合認(rèn)為，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)是10%時(shí)，堿性蛋白酶的自由基清除能力達(dá)到最佳。

酶含量<2000U/g時(shí)，3種自由基清除能力高低和酶濃度大小之間呈正比關(guān)系;酶含量是2000U/g時(shí)，，各自由基清除能力均達(dá)到峰值;>2000U/g，各自由基清除能力均穩(wěn)定降低。酶添加量過(guò)多，容易造成酶之間形成較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)蛋白酶解過(guò)程會(huì)形成一定抑制作用。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，酶含量是2000U/g時(shí)，蛋白酶解物清除自由基的能力最佳。

伴隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，三種自由基的清除能力均有提高，持續(xù)酶解4h后自由基的清除能力趨于穩(wěn)定且稍降低。4h內(nèi)反應(yīng)快速，小麥蛋白和酶結(jié)合成分，生成大量的小麥多肽，這是提升自由基清除率的重要基礎(chǔ)。反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不僅容易造成小麥多肽過(guò)早氧化，也可能提高生產(chǎn)成本，選擇酶解的最佳酶解時(shí)間4h。

3.1.2 酶解響應(yīng)面試驗(yàn)

回歸擬合試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，獲得響應(yīng)面回歸方程。分析回歸方差發(fā)現(xiàn)，基于實(shí)驗(yàn)各指標(biāo)建設(shè)的二次回歸模型之間形成了顯著差異（P<0.01），各Y1、Y2、Y3響應(yīng)值的失擬項(xiàng)依次是0.437、0.144、0.183，都在0.05以上，提示模型和實(shí)際數(shù)據(jù)擬合較好，回歸方程位失擬。利用變異系數(shù)（CV）表示實(shí)驗(yàn)自身的精準(zhǔn)性，本試驗(yàn)各響應(yīng)值的CV值依次為4.06%、4.86%、3.77%，CV值偏小，代表試驗(yàn)的可靠性較高。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，酶濃度對(duì)以上三種自由基清除效果形成的影響最大。當(dāng)酶濃度恒定時(shí)，伴隨底物濃度的增加，各自由基清除率均表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，但下降趨勢(shì)并不顯著。觀察等高線圖，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)11-12%，酶含量2000-300U/g，優(yōu)化三種自由基清除率能得到峰值。

第1步酶解最佳工藝參數(shù)：底物內(nèi)堿性蛋白酶的含量11.3%，酶含量、pH對(duì)應(yīng)值分別是2210U/g、8.4，55℃溫度條件下持續(xù)酶解4.4h;預(yù)估DPPH、O2-、·OH清除率分別為60.26%、58.85%、60.06%。

3.2 風(fēng)味蛋白酶

3.2.1酶解試驗(yàn)結(jié)果

風(fēng)味蛋白酶添加量1000U/g時(shí)，對(duì)自由基清除效果最佳，此時(shí)測(cè)得DPPH、O2-、·OH清除率依次是71.23%、68.32%、72.07%。酶解適宜時(shí)間2h，以上三種自由基清除率76.58%、74.12%、77.86%。

3.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)

結(jié)合方差計(jì)算結(jié)果，利用各指標(biāo)建設(shè)的二次回歸模型，其間存在十分顯著的差異（P<0.01），各響應(yīng)值的失擬項(xiàng)均>0.05，提示本模型和實(shí)際數(shù)據(jù)之間形成了良好的擬合關(guān)系，可采用該回歸方程分析試驗(yàn)結(jié)果。校正系數(shù)依次是0.898，、0.944、0.932，提示運(yùn)用該模式能依次解釋89.8%、94.4%、93.2%的響應(yīng)值改變。本試驗(yàn)各響應(yīng)值的變異系數(shù)（CV）分別是3.1%、1.98%、2.51%，CV值較低，提示試驗(yàn)可靠性較高?？刹捎眠@種模型分析與預(yù)測(cè)小麥蛋白酶解第2步，Design-Expert V8.0.6軟件模擬優(yōu)化回歸方程，得出最佳工藝參數(shù)：pH、溫度分別為1075U/g、6.6、50℃時(shí)酶解處理風(fēng)味蛋白酶2.3h，自由基DPPH、O2-、·OH清除率分別75.37%、74.52%、76.28%。

結(jié)束語(yǔ)

應(yīng)用堿性及風(fēng)味蛋白酶分步酶解法酶解處理小麥蛋白，能成功制備出高抗氧化性小麥肽，分別獲得第1、2步最佳工藝參數(shù)，最后測(cè)得自由基DPPH、O2-、·OH清除率分別75.37%、74.52%、76.28%。

作者簡(jiǎn)介：

劉世欣（1988.4-），女，河南安陽(yáng)人，本科，研究方向：淀粉糖品控。