田 瑛 鄧小敏 蘇 冬 王振剛 方桂玉 毛發(fā)林

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧市 530001，電子郵箱:1244897242@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，南寧市 530023)

近年來，糖尿病已成為繼癌癥、心血管疾病之后的威脅人類健康的第三大疾病。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病患病率及致死率呈逐年上升趨勢[1]；新近發(fā)布的國際糖尿病聯(lián)盟2019全球糖尿病地圖(第9版)顯示，全球約4.63億人罹患糖尿病，中國位居全球首位，患者數(shù)量達(dá)1.16億[2]。目前尚無有效治愈糖尿病的方案，西藥降糖臨床效果好，但長期使用副作用大且易產(chǎn)生藥物依賴，不能有效預(yù)防及控制并發(fā)癥[3]。相關(guān)研究表明，中藥治療控制血糖有效，副作用少[4]，可有效預(yù)防及治療糖尿病并發(fā)癥[5]。增液湯(玄參、生地黃、麥冬)作為臨床廣泛應(yīng)用的中藥湯劑，前期已有實驗表明其能降低糖尿病小鼠的血糖，并改善糖尿病小鼠的糖耐量[6]。但目前增液湯的降糖機(jī)制尚未明確，這限制了增液湯在國內(nèi)外臨床的廣泛應(yīng)用。而中藥復(fù)方的多藥物、多成分、多靶點特點與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法相契合，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥的系統(tǒng)研究提供了具體方法[7-8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析增液湯治療糖尿病的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 活性化合物的篩選 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)篩選增液湯3味中藥(包括玄參、生地黃、麥冬)的活性化合物。篩選條件：生物利用度(oral bioavailability，OB)表示口服的藥物到達(dá)血液循環(huán)所占口服劑量的比例，一般是決定生物活性分子類藥性的關(guān)鍵指標(biāo)，因而設(shè)置OB≥30%；具有較高的類藥性(drug likeness，DL)的化合物才能在口服吸收過程中被安全送達(dá)靶器官發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，因而設(shè)置DL≥0.18；剔除沒有相關(guān)信息的化學(xué)成分。

1.2 活性化合物的靶點預(yù)測 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫收集增液湯活性化合物的作用靶點，使用 UniProt(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對所有靶點名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

1.3 糖尿病相關(guān)基因的篩選 使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)對糖尿病相關(guān)的基因進(jìn)行篩選，匯總、去重后，將增液湯活性化合物的作用靶點網(wǎng)絡(luò)映射到糖尿病相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)中，2個網(wǎng)絡(luò)中重疊的基因即被認(rèn)為是增液湯中藥活性成分干預(yù)糖尿病的靶點。

1.4 可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選出的增液湯活性成分及其靶點以及糖尿病的相關(guān)基因?qū)隒ytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建增液湯“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中“節(jié)點(node)”代表增液湯中的活性成分和作用靶點，“邊(edge)”代表活性成分、作用靶點間的相互關(guān)系。并對可視化網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，其中，靶點度值(Degree)和中介中心度是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中兩個重要的參數(shù)，可用于評價增液湯有效化合物、靶標(biāo)的重要程度。度值和介數(shù)中心數(shù)越大，說明靶點越處于PPI網(wǎng)絡(luò)中心，發(fā)揮關(guān)鍵作用。圖中靶點圓越大，表明度值和介數(shù)中心數(shù)越大。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將增液湯活性成分作用靶點和糖尿病相關(guān)基因重疊的靶點上傳至在線分析工具STRING(https://string-db.org/)，參數(shù)設(shè)置評分條件≥0.7(高等置信度)，隱藏圖中游離的蛋白質(zhì)，輸出string_interactions.tsv文件，導(dǎo)入Cytoscape以增強(qiáng)其可讀性，獲取蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)信息，根據(jù)在string中設(shè)置的高等置信度的篩選條件明確PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白。

1.6 增液湯治療糖尿病相關(guān)基因的功能分析和通路分析 利用在線分析工具DAVID(Version 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)分析，包括生物過程、細(xì)胞成分、分子功能，選擇P<0.05的項目進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件將這些條目做成可視化條形圖。利用DAVID平臺進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析，將結(jié)果導(dǎo)入在線分析平臺OmicShare(http://www.omicshare.com)，對增液湯治療糖尿病相關(guān)基因的核心通路進(jìn)行篩選及注釋。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物篩選結(jié)果和靶點預(yù)測結(jié)果 最終獲得243個活性化合物進(jìn)行后續(xù)分析。243個活性化合物共得到212個作用靶點，與獲得的251個糖尿病相關(guān)的基因進(jìn)行映射，得到49個重疊靶點，見圖1。

圖1 增液湯活性成分作用靶點與糖尿病相關(guān)基因的共有靶點韋恩圖

2.2 可視化網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)圖 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖2。根據(jù)藥物-靶標(biāo)相互作用預(yù)測的靶標(biāo)預(yù)測算法給出的評分遞減順序?qū)ζ漕A(yù)測的候選靶標(biāo)進(jìn)行排序。分?jǐn)?shù)為%3E=“分?jǐn)?shù)截止”的預(yù)測候選目標(biāo)(包括由藥物數(shù)據(jù)庫、KEGG和TTD支持的已知直接目標(biāo))將被假設(shè)為查詢化合物的潛在目標(biāo)。建立增液湯中藥藥活性成分干預(yù)糖尿病的靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，涉及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鼠雙微粒體2(murine double minute 2,MDM2)、表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)等多個關(guān)鍵靶點。

圖2 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 增液湯治療糖尿病相關(guān)基因的GO分析結(jié)果 對增液湯治療糖尿病的49個候選靶點進(jìn)行GO富集分析。在滿足FDR<0.01條件下，生物過程共有29條，包括細(xì)胞對外來刺激的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)、神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)等；分子功能共有4條，包括薄膜筏、膜微域、膜區(qū)域等；細(xì)胞組分共有6條，包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等。將排名靠前的3個條目繪制成條形圖，見圖4。

圖4 GO分析結(jié)果(前3條)

2.4 增液湯治療糖尿病相關(guān)基因的KEGG富集分析和核心通路篩選結(jié)果 共富集出58條信號通路，包括磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路和缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，見圖5、圖6、圖7。

圖5 KEGG分析結(jié)果(根據(jù)FDR校正后得的P值進(jìn)行排列，選前20條)

圖6 PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

圖7 HIF-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3 討 論

糖尿病屬中醫(yī)“消渴病”范疇，以多飲、多食、多尿、形體消瘦為主要特征?！吨T病源候論》提到“五臟六腑，皆有津液。若臟腑因虛實而生熱者，熱氣在內(nèi)，則津液竭少，故渴也”。消渴形成的關(guān)鍵在于“津液竭”，津液敷布失常，引起津不上承煩渴多飲，津液直趨下行頻數(shù)多尿，肌膚失潤“消肌膚”而形體消瘦。增液湯首載于《溫病條辨》，有增液潤燥之效，可解消渴病之津傷液竭[9]，但其降糖的作用機(jī)制尚不明確。中藥復(fù)方具有藥味多，成分復(fù)雜，通過調(diào)整藥量、炮制方法、配伍等多因素治療疾病的特點。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以“多成分-多靶點-多途徑”為網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建思想，與中藥復(fù)方的特點不謀而合，為中藥復(fù)方的研究提供了新方向[10-11]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，共篩選出增液湯活性成分與相關(guān)基因的共同靶點49個，包括Akt1、MDM2等多個關(guān)鍵靶點。其中，Akt1參與多種生物學(xué)過程，包括代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長、胰島素信號傳導(dǎo)和血管生成等[12]，其激活依賴于PI3K途徑，并被認(rèn)為是該途徑的中心節(jié)點。麥冬皂苷為增液湯中麥冬的主要有效成分之一[13]，其可能是通過抑制Akt1及其下游蛋白哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的自噬能力，從而改善糖尿病大鼠的心臟功能[14]。p53作為腫瘤抑制因子，活化后通過參與糖代謝、脂肪酸代謝等途徑而在代謝平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。而MDM2癌基因是p53的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[15]，其能通過抑制p53來抑制糖尿病腎病小鼠核因子紅系2相關(guān)因子2的抗氧化活性，以達(dá)到預(yù)防糖尿病腎病的目的[16]，這提示激活MDM2和抑制p53或為防治糖尿病腎病的新方向。

我們進(jìn)一步針對增液湯作用于糖尿病的49個作用靶點進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)作用靶點涉及細(xì)胞對外來刺激的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)、神經(jīng)元死亡的調(diào)節(jié)等生物過程，薄膜筏、膜微域、膜區(qū)域等細(xì)胞組分，泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等分子功能。糖尿病是一種與營養(yǎng)過剩有關(guān)的疾病，是一種常見的代謝紊亂，通常先于代謝綜合征發(fā)生，與胰島素抵抗、血脂異常和高血壓等相互關(guān)聯(lián)[17]。代謝性炎癥與各種細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激有關(guān)，例如線粒體氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬缺陷[18]。而炎癥也是糖尿病中的一個基本生物學(xué)過程。因此，適當(dāng)調(diào)節(jié)這些機(jī)制對于防止初始炎癥反應(yīng)不受控制以及疾病發(fā)展至關(guān)重要[19]。

本研究中，KEGG分析富集出了58條信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、mTOR信號通路等，其中PI3K-Akt信號通路是2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的經(jīng)典通路。Yang等[20]發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽改善糖尿病大鼠認(rèn)知障礙的作用機(jī)制可能與激活絲裂原活化蛋白激酶和PI3K-Akt信號通路有關(guān)。師林等[21]通過檢測存在胰島素抵抗的脾虛痰濕型肥胖2型糖尿病大鼠的血脂、血糖水平及蛋白情況，發(fā)現(xiàn)該藥方可能通過良性調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗。因此，我們推測增液湯可能主要通過激活其下游分子Akt1以調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路，從而促進(jìn)胰島素的分泌、改善胰島功能等過程，進(jìn)而發(fā)揮對2型糖尿病的干預(yù)作用。

綜上所述，增液湯治療糖尿病具有多靶點、多通路作用的特點，其可能是通過激活下游分子Akt1，調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路，促進(jìn)胰島素的分泌、改善胰島功能等過程，對糖尿病進(jìn)行干預(yù)。本研究利用多個數(shù)據(jù)庫綜合分析，所得結(jié)果有一定置信度，但中藥復(fù)方的功效與其中各藥物的產(chǎn)地、炮制方法、配伍、煎藥方式、用藥劑量等因素密切相關(guān)，中醫(yī)遵從“因人、因時、因地”三因制宜的治療方法，這使得中藥復(fù)方起效的機(jī)制復(fù)雜化。本研究僅對增液湯本身的化合成分及作用靶點等進(jìn)行分析，尚未涉及藥物與人、時、地的相互作用，不能完全詮釋中藥復(fù)方的精髓所在。但采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對中藥復(fù)方進(jìn)行化合物分析、作用靶點預(yù)測、信號通路富集等將提高中醫(yī)藥的國際認(rèn)可度，更好地推動中醫(yī)藥走向世界。