miR-384增加乳腺癌MCF-7細胞多西他賽敏感性

智英輝 楊永強 左東明

(石家莊市第一醫(yī)院普外三科，河北 石家莊 050000)

乳腺癌是一種死亡率高、預后差、發(fā)展速度快的女性常見實體惡性腫瘤，手術(shù)切除和放化療是目前乳腺癌治療的常見手段[1]。研究報道表明，乳腺癌中異常表達的基因參與乳腺癌進程，并且這些異常表達的基因有望成為腫瘤治療的靶點[2]。多西他賽(DOC)是臨床常用的抗腫瘤藥物，其可以抑制乳腺癌細胞增殖和促進細胞凋亡[3]。miRNA是一種非編碼RNA，參與細胞生長、分化、凋亡，miRNA屬于多功能調(diào)控因子，其作用機制與靶向影響下游基因的表達有關(guān)[4]。miRNA參與腫瘤進程，miRNA調(diào)控腫瘤細胞惡性生長、轉(zhuǎn)移等過程[5]。miR-384是一個與腫瘤有關(guān)的miRNA，其在腎細胞癌、舌鱗狀細胞癌等腫瘤中發(fā)揮類似抑癌基因的作用，miR-384表達下調(diào)與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[6-7]。之前的研究報道發(fā)現(xiàn)miR-384在乳腺癌中表達缺失，miR-384能夠體外抑制乳腺癌細胞侵襲和遷移[8]。目前對于miR-384對乳腺癌細胞凋亡和DOC敏感性的作用還不清楚。我們前期的預實驗發(fā)現(xiàn)性別決定區(qū)Y框蛋白4(sex-determining region Y-box 4,SOX4)和miR-384可能互為靶向關(guān)系，miR-384作用機制可能與SOX4有關(guān)。SOX4是一個在乳腺癌等腫瘤中高表達的促腫瘤因子，下調(diào)其表達可以抑制癌細胞增殖并誘導癌細胞凋亡[9]。本研究旨在探討miR-384對乳腺癌MCF-7細胞DOC敏感性的影響和作用機制，以期為乳腺癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌MCF-7細胞購自上海弘順生物科技有限公司；miR-384模擬物、模擬物陰性對照購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；SOX4抗體購自美國GeneTex公司；DOC購自北京中碩醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司；pcDNA3.1-SOX4、pcDNA3.1由上海正茂生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 實驗分組處理 MCF-7細胞分成Control組、miR-NC組、miR-384組、miR-NC+DOC組、miR-384+DOC組。miR-NC組、miR-NC+DOC組分別為轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照后的MCF-7細胞；miR-384組、miR-384+DOC組細胞分別為轉(zhuǎn)染miR-384模擬物后的MCF-7細胞；miR-NC+DOC組、miR-384+DOC組細胞在轉(zhuǎn)染后24 h用含有5μmol/LDOC的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；Control組細胞為空白對照細胞。MCF-7細胞生長密度達到70%時，用Lipofectamin 2000進行常規(guī)細胞轉(zhuǎn)染。MCF-7細胞以含有10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。

1.3 Realtime PCR測定上調(diào)效果 收集培養(yǎng)48 h以后的Control組、miR-NC組、miR-384組細胞，嚴格按照Trizol試劑說明提取RNA。以無RNA酶水將5 μL的RNA稀釋100倍，用分光光度計測定OD260/280的比值。以cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用ABI StepOne Plus實時PCR儀進行Realtime PCR反應，結(jié)果以2-ΔΔCt法計算。PCR體系為：9 μL的SYBR Green Mix、2 μL的上下游引物、2 μL的cDNA，添加RNase-free至20 μL。PCR反應的參數(shù)為：預變性(95 ℃，20 s)，變性(95 ℃，10 s)，退火(60 ℃，20 s)，延伸(70 ℃，10 s)，循環(huán)35次。U6作為內(nèi)參，分析miR-384表達變化。PCR引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。miR-384上游5′-TGTT AAATCAGGAATTTTAA-3′，下游5′-TGTTACAG GCATTATGA-3′。U6上游5′-TGTTACAGGCAT TATGA-3′，下游5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.4 MTT方法測定細胞增殖 將MCF-7細胞以3×104個/mL濃度種植到96孔板內(nèi)，按照Control組、miR-NC組、miR-384組、miR-NC+DOC組、miR-384+DOC組分組處理，細胞培養(yǎng)48 h以后，將培養(yǎng)板取出，在每個孔中添加20 μL的MTT，放在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置4 h。小心將孔內(nèi)的上清液吸棄，各孔添加150 μL的DMSO溶液，混合均勻以后，測定490 nm波長條件下每個孔的OD值，OD值代表細胞增殖情況。

1.5 克隆形成實驗測定細胞克隆形成能力 取Control組、miR-NC組、miR-384組、miR-NC+DOC組、miR-384+DOC組細胞，接種到細胞培養(yǎng)皿中，使每個培養(yǎng)皿中添加200個細胞，細胞培養(yǎng)14 d以后，除去培養(yǎng)皿，用體積分數(shù)為95%的乙醇固定，0.1%的結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機選7個視野，計數(shù)細胞克隆形成數(shù)目，細胞克隆團以≥50個細胞為標準。

1.6 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 收集已經(jīng)培養(yǎng)48 h以后的Control組、miR-NC組、miR-384組、miR-NC+DOC組、miR-384+DOC組細胞，用PBS將各組細胞懸浮3次。在細胞沉淀中分別添加195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合溶液充分混合，再添加5 μL的Annexin V-FITC混勻，放在室溫條件中結(jié)合10 min。1000 g離心10 min，將染液吸棄，繼續(xù)加入Annexin V-FITC結(jié)合溶液190 μL，添加PI染色液10 μL，混勻后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.7 miR-384靶基因預測和鑒定 利用在線生物學軟件targetscan分析miR-384的靶基因，結(jié)果顯示SOX4的3′UTR端與miR-384有堿基互補結(jié)合位點，用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系[9]。合成SOX4的3′UTR端突變以后的MUT熒光素酶報告載體和SOX4的3′UTR端無突變的WT熒光素酶報告載體，將WT、MUT分別與miR-384模擬物、模擬物陰性對照共轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞中，48 h以后，用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性變化。熒光素酶報告載體由云舟生物科技(廣州)有限公司合成。

1.8 Western blot測定SOX4蛋白表達 收集培養(yǎng)48 h以后的Control組、miR-NC組、miR-384組細胞，提取細胞總蛋白。蛋白樣品在進行SDS-PAGE凝膠電泳之前需與Loading Buffer混合煮沸5 min。SDS-PAGE電泳電壓條件設置為：90 V電泳30 min，120 V電泳2 h。等到溴酚藍染料電泳至凝膠的底部邊緣以后，停止電泳，取出凝膠。將NC膜裁剪成合適大小，在4 ℃、60 V電壓條件下轉(zhuǎn)膜50 min。NC膜經(jīng)過5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，再依次放在一抗和二抗稀釋液中，在室溫條件下結(jié)合2 h。ECL方法顯色。掃描條帶的灰度值，內(nèi)參設置為GAPDH，分析目的蛋白SOX4表達水平。SOX4抗體以1∶800稀釋，二抗以1∶4000稀釋。

1.9 pcDNA3.1-SOX4對上調(diào)miR-384影響MCF-7細胞增殖、克隆和凋亡的作用檢測 MCF-7細胞中共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX4、miR-384模擬物和pcDNA3.1、miR-384模擬物，用含有5 μmol/L DOC的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為miR-384+DOC+SOX4組和miR-384+DOC+NC組，細胞培養(yǎng)48 h以后，參照上述步驟，用MTT方法測定細胞增殖，克隆形成實驗測定細胞克隆形成能力，流式細胞術(shù)測定細胞凋亡，Western blot測定SOX4蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 miR-384模擬物上調(diào)MCF-7細胞中miR-384表達水平 MCF-7細胞轉(zhuǎn)染miR-384模擬物后，細胞中miR-384表達水平升高(P<0.05)。miR-384模擬物上調(diào)MCF-7細胞中miR-384表達水平。見圖1、表1。

圖1 miR-384模擬物轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞中miR-384表達水平Figure 1 The expression level of miR-384 in MCF-7 cells after miR-384 transfection注：與miR-NC組比較，①P<0.05

表1 miR-384模擬物轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞中miR-384表達水平Table 1 The expression level of miR-384 in MCF-7 cells after miR-384模擬物 transfection

2.2 上調(diào)miR-384聯(lián)合DOC對乳腺癌細胞增殖、克隆和凋亡影響 上調(diào)miR-384或DOC處理后的MCF-7細胞OD值降低，克隆形成數(shù)目減少，細胞凋亡率升高(P<0.05)；上調(diào)miR-384聯(lián)合DOC處理后的MCF-7細胞OD值降低更多，細胞克隆數(shù)目減少更多，細胞凋亡率也更高(P<0.05)。上調(diào)miR-384聯(lián)合DOC抑制乳腺癌細胞生長并誘導細胞凋亡。見圖2、表2。

表2 上調(diào)miR-384聯(lián)合DOC處理后MCF-7細胞OD值、克隆形成數(shù)目、凋亡率Table 2 Up-regulation of OD value,number of clone formation,and apoptosis rate of MCF-7 cells after treatment with miR-384 combined with docetaxel

2.3 miR-384靶向負調(diào)控SOX4 在線靶基因軟件預測miR-384與SOX4的3′UTR端有結(jié)合位點，miR-384模擬物和WT共轉(zhuǎn)染后的MCF-7細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；miR-384模擬物轉(zhuǎn)染后的MCF-7細胞中SOX4蛋白表達水平下降(P<0.05)。miR-384靶向負調(diào)控SOX4。見圖3、表3、表4。

表3 miR-384模擬物和WT、MUT共轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞熒光素酶活性Table 3 Luciferase activity of MCF-7 cells after co-transfection with miR-384 mimic,WT and MUT

圖3 miR-384靶向負調(diào)控SOX4Figure 3 miR-384 targets the negative regulation of SOX4A.miR-384與SOX4的3′UTR端結(jié)合位點；B.細胞熒光素酶活性；C.Western blot測定SOX4蛋白表達；D.SOX4蛋白表達水平比較。與miR-NC組比較，①P<0.05

表4 miR-384模擬物轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞中SOX4蛋白水平Table 4 SOX4 protein levels in MCF-7 cells after miR-384 mimic transfection

2.4 pcDNA3.1-SOX4逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-384聯(lián)合DOC對MCF-7細胞生長和凋亡的影響 與共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、miR-384模擬物的細胞相比，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOX4和miR-384模擬物的MCF-7細胞經(jīng)過DOC處理以后，細胞OD值升高，克隆形成數(shù)目也升高，細胞凋亡率降低，細胞中SOX4蛋白表達水平升高(均P<0.05)，見圖4、表5。

圖4 pcDNA3.1-SOX4和miR-384模擬物共轉(zhuǎn)染后對DOC處理的MCF-7細胞增殖、克隆、凋亡和SOX4蛋白表達影響Figure 4 Effects of Co-transfection of pcDNA3.1 SOX4 and Mir 384 mimics on proliferation,cloning,apoptosis and SOX4 protein expression of MCF 7 cells treated with DOC注：A.MTT檢測細胞增殖；B.克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù)目比較；C.流式細胞術(shù)測定細胞凋亡；D.細胞凋亡率比較；E.Western blot測定細胞中SOX4蛋白表達；F.SOX4蛋白表達水平比較。與miR-384+DOC+NC組比較，①P<0.05

表5 pcDNA3.1-SOX4和miR-384模擬物共轉(zhuǎn)染后對DOC處理的MCF-7細胞OD值、克隆形成數(shù)目、凋亡率和SOX4蛋白水平影響Table 5 The effect of co-transfection of pcDNA3.1-SOX4 and miR-384 mimic on the OD value,number of clone formation,apoptosis rate and SOX4 protein level of docetaxel-treated MCF-7 cells

3 討論

miRNA是在細胞生長、組織修復、胚胎發(fā)育等過程中作用廣泛的小分子RNA，其沒有開放閱讀框，缺乏編碼蛋白質(zhì)的能力[10]。miRNA與腫瘤的關(guān)系十分密切，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與腫瘤轉(zhuǎn)移、生長等有關(guān)的miRNA，這些miRNA不僅可以作為腫瘤進程的分子標記物，還可能成為腫瘤治療過程中的有效靶點[11]。miR-384參與腫瘤進程，目前已知其在肝癌、胰腺癌等細胞生長中發(fā)揮抑制作用，miR-384可能是一個腫瘤抑制因子[12-13]。miR-384在乳腺癌中表達下調(diào)，上調(diào)其表達可以抑制乳腺癌細胞的侵襲、遷移和EMT，可能是一個乳腺癌抑制因子[8]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-384后的乳腺癌細胞增殖和克隆形成能力下降，細胞凋亡增多，提示上調(diào)miR-384誘導乳腺癌細胞凋亡，與上述研究結(jié)果相符合，說明miR-384在乳腺癌進程中可能發(fā)揮類似抑癌基因的作用。

DOC是一種常見的抗腫瘤藥物，其可以誘導腫瘤細胞凋亡并抑制細胞增殖[14]。本次實驗表明，DOC處理后的乳腺癌細胞增殖能力下降，細胞凋亡率升高，并且上調(diào)miR-384協(xié)同DOC共同誘導乳腺癌細胞凋亡和增殖抑制，提示miR-384能夠增加乳腺癌細胞DOC敏感性。

miRNA功能廣泛與其作用機制復雜有關(guān)，其能夠通過調(diào)控不同組織中不同的靶基因影響不同生理或病理進程[15-16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-384與SOX4互為靶向關(guān)系，并且miR-384可以靶向下調(diào)SOX4蛋白的表達。SOX4是一種單外顯子基因，其能夠編碼474個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，SOX4蛋白含有C端轉(zhuǎn)錄激活和N端高度保守結(jié)構(gòu)域[17-19]。SOX4在神經(jīng)系統(tǒng)、脾臟、卵巢、胸腺等組織中表達，參與骨骼發(fā)育、免疫系統(tǒng)發(fā)育[20]。研究表明，SOX4在腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮促進作用，其能夠促進胃癌、乳腺癌等腫瘤細胞的生長并減少細胞凋亡[21-22]。本次實驗證實，上調(diào)SOX4可以逆轉(zhuǎn)miR-384聯(lián)合DOC對乳腺癌細胞增殖抑制和凋亡促進作用，提示miR-384在乳腺癌細胞DOC敏感性中的作用機制與靶向負調(diào)控SOX4有關(guān)。

4 結(jié)論與啟示

miR-384能夠誘導乳腺癌細胞凋亡，增加乳腺癌細胞DOC敏感性，作用機制與靶向調(diào)控SOX4有關(guān)。miR-384在乳腺癌進展中可能發(fā)揮抑制作用，miR-384可能是增加乳腺癌DOC敏感性的有效靶點。在今后的實驗中會繼續(xù)研究miR-384調(diào)控網(wǎng)絡的下游機制，為明確乳腺癌發(fā)生機制和提高乳腺癌患者生存期提供參考依據(jù)。