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      多穗柯總黃酮對db/db小鼠胰高血糖素樣肽-1分泌的影響

      2021-10-30 11:50:59陳敬民李燕婧
      云南中醫(yī)中藥雜志 2021年10期
      關(guān)鍵詞:高血糖素空腹黃酮

      陳敬民 李燕婧

      摘要:目的 探討多穗柯總黃酮對db/db小鼠腸道胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)分泌的影響。方法 選取db/db雄性小鼠按空腹血糖值隨機(jī)分組,多穗柯總黃酮以100、200 mg/kg劑量灌胃給藥4 w,進(jìn)行糖負(fù)荷GLP-1分泌實驗,然后處死動物,取回腸組織,免疫熒光法檢測分泌GLP-1的細(xì)胞情況,測量食耗量、飲水量、空腹血糖值、血清GLP-1及分泌GLP-1細(xì)胞比例。結(jié)果 多穗柯總黃酮100或200 mg/kg劑量組均能顯著減少db/db小鼠周食耗量(P<0.05或P<0.01)、周飲水量(P<0.01);降低空腹血糖值(P<0.05或P<0.01);顯著升高空腹GLP-1水平(P<0.01)。多穗柯總黃酮200 mg/kg劑量組能顯著升高糖負(fù)荷后30、60 min的血清GLP-1水平(P<0.05);增加分泌GLP-1的細(xì)胞比例(P<0.01)。結(jié)論 多穗柯總黃酮通過減少腸道L細(xì)胞損傷,保護(hù)其分泌GLP-1的功能,增加GLP-1的分泌,發(fā)揮防治糖尿病作用。

      關(guān)鍵詞:多穗柯總黃酮;糖尿病;胰高血糖素樣肽-1

      中圖分類號:R285.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A?? 文章編號:1007-2349(2021)10-0079-04

      胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是腸道Langerhans細(xì)胞分泌的腸肽類激素,GLP-1能再生和修復(fù)胰島β細(xì)胞,增加β細(xì)胞數(shù)量并抑制其凋亡,提高β細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量,改善β細(xì)胞功能[1]。通過提高體內(nèi)GLP-1水平改善胰島β細(xì)胞功能,進(jìn)而提高胰島素分泌水平,從而達(dá)到防治糖尿病的目的,是藥物治療糖尿病重要作用機(jī)制之一。

      多穗柯是殼斗科植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.的干燥嫩葉,富含以根皮苷(Phlorizio-1),三葉苷(Trilobation-2),3-羥基根皮苷(3-hydroxy phlorizin-3)為主的黃酮類物質(zhì)[2,3],具有潤肺鎮(zhèn)咳、滋潤肝腎、清熱利尿等效用,系廣西瑤族地區(qū)常用于降血糖的民間草藥。本課題組人員曾研究發(fā)現(xiàn)其在治療糖尿病方面有顯著的藥理作用[4],本實驗利用db/db小鼠糖尿病模型,在考察糖負(fù)荷GLP-1變化基礎(chǔ)上,結(jié)合免疫熒光技術(shù),探討多穗柯總黃酮防治糖尿病的作用機(jī)制。

      1 材料

      1.1 實驗動物 SPF級C57、db/db小鼠,雄性,購自常州卡文斯實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2016-0010,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥研究院動物房,實驗動物使用許可證號:SYXK桂2016-0006,飼養(yǎng)溫度(22±2)℃,環(huán)境相對濕度(50±5)%,無菌水,標(biāo)準(zhǔn)鼠料,12小時自由進(jìn)食/12小時禁食,自由飲水。本實驗遵守國家有關(guān)實驗動物保護(hù)與使用準(zhǔn)則。

      1.2 藥物與試劑 多穗柯來源于廣西百色,經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院饒偉源主任中藥師鑒定為殼斗科植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.的干燥嫩葉;鹽酸二甲雙胍片(批號:190610),北京京豐制藥集團(tuán)有限公司;卓越金采血糖試紙,羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司;4%多聚甲醛,北京博奧拓達(dá)科技有限公司;小鼠胰高血素樣肽-1(GLP-1)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒,上海仁捷生物科技有限公司;Anti-GLP-1 Rabbit pAb抗體,Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(紅色),細(xì)胞核染色劑DAPI,均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

      1.3 主要儀器 卓越精采血糖儀(羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);Thermo 1510酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司);Eclipse Ci-L正置熒光拍照顯微鏡(日本Nikon公司);Image-pro Plus 6.0圖片分析軟件(美國Media Cybemetics公司)。

      1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)以(x[TX-*3/8]±s)表示,采用單因素方差分析,組間進(jìn)行LSD檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 方法

      2.1 多穗柯總黃酮的制備 多穗柯藥材粉碎,70%乙醇溶液以10:1液藥比回流提取2次,每次2 h,提取液濾過,濃縮成稠膏,用溫蒸餾水稀釋,上大孔樹脂,水、乙醇梯度洗脫,收集50%醇洗脫部分,濃縮,冷凍干燥成粉未,284 nm處檢測總黃酮含量為89%。

      2.2 實驗分組與給藥[5] 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,C57小鼠為正常對照組,db/db小鼠尾靜脈針刺取血,血糖儀測空腹血糖值,按血糖值隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍83 mg/kg組、多穗柯總黃酮100和200 mg/kg組,每組8只,每籠2只分籠飼養(yǎng)。各給藥組灌胃給藥,給藥體積為20 mL/kg,連續(xù)28 d,正常對照組及模型組給予蒸餾水,每周均測量各鼠空腹血糖、食耗量及飲水量。

      2.3 糖負(fù)荷GLP-1分泌實驗[6-7] 末次給藥前尾靜脈取血,給藥1 h后進(jìn)行實驗,各鼠分別按1 g/kg灌胃給予10%葡萄糖溶液,并于口服葡萄糖后30、60、120 min尾靜脈取血,血液3000 r/min離心10 min,分離血清,測量小鼠血清GLP-1含量,計算各組小鼠血清GLP-1的均數(shù)方差。

      2.4 腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞檢測[8-10] 實驗結(jié)束后禁食12 h,脫頸椎處死小鼠,冰臺上清理脂肪,迅速取回腸組織,4℃生理鹽水清洗腸道,置4%多聚甲醛固定24 h,進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗覆蓋、DAPI復(fù)染,淬滅封片,熒光拍照顯微鏡下檢查,每張切片選取3個目的區(qū)域200倍成像,拍攝GLP-1及DAPI熒光照片,使用圖片分析軟件分析回腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞及其他細(xì)胞數(shù),計算分泌GLP-1的L細(xì)胞百分率。

      L細(xì)胞百分率=回腸GLP-1染色區(qū)域面積/(GLP-1及DAPI染色區(qū)域面積總和)×100%

      3 結(jié)果

      3.1 對db/db小鼠食耗量和飲水量的影響 結(jié)果如表1、表2所示,與正常對照組比較,模型組小鼠周食耗量、周飲水量隨時間進(jìn)行性顯著增多(P<0.01)。與模型組比較,多穗柯總黃酮100、200 mg/kg組的周食耗量、周飲水量顯著減少(P<0.05或P<0.01)。

      3.2 對db/db小鼠空腹血糖的影響 結(jié)果如表3所示,與正常對照組比較,模型組小鼠空腹血糖隨時間進(jìn)行性顯著增高(P<0.01)。與模型組比較,多穗柯總黃酮以100 mg/kg給藥7、14 d或以200 mg/kg給藥均顯著降低空腹血糖(P<0.05或P<0.01)。

      3.3 對db/db小鼠血清胰高血糖素樣肽1(GLP-1)的影響 結(jié)果如表4所示,與正常對照組比較,模型小鼠空腹、口服葡萄糖后血清GLP-1含量明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,多穗柯總黃酮100、200 mg/kg連續(xù)給藥28 d顯著升高空腹血清GLP-1含量(P<0.01),多穗柯總黃酮200 mg/kg連續(xù)給藥28 d能顯著升高口服葡萄糖后0.5、1.0 h的血清GLP-1含量(P<0.05)。

      3.4 對db/db小鼠分泌GLP-1細(xì)胞的影響 結(jié)果如表5所示,與正常對照組比較,模型組小鼠回腸分泌GLP-1的L細(xì)胞數(shù)明顯減少,腸組織細(xì)胞中的比例顯著降低(P<0.01);與模型組比較,多穗柯總黃酮200 mg/kg連續(xù)給藥28 d明顯增加回腸分泌GLP-1的L細(xì)胞數(shù),腸組織細(xì)胞中的比例顯著增加(P<0.01)。腸組織免疫熒光檢查結(jié)果如圖1所示,正常對照組腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞層連續(xù)光滑、致密,模型組小鼠腸組織分泌GLP-1的L細(xì)胞層斷續(xù)、離散,多穗柯總黃酮100、200 mg/kg連續(xù)給藥28 d能使db/db小鼠分泌GLP-1細(xì)胞層形態(tài)連續(xù)性、致密度明顯優(yōu)于模型組。

      4 討論

      db/db小鼠是C57小鼠4號染色體瘦素受體基因定向敲除引起的一種自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠,具有和人類2型糖尿病相似的臨床癥狀,有多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗等特征,是理想2型糖尿病模型[11]。與正常對照組比較,模型組食耗量、飲水量及空腹血糖值顯著增高(P<0.01);與模型組比較,多穗柯總黃酮連續(xù)給予28 d,db/db小鼠多飲多食的糖尿病癥狀明顯改善(P<0.05或P<0.01),表明多穗柯總黃酮能較好改善db/db小鼠糖尿病癥狀的作用。

      GLP-1受進(jìn)食、胃腸神經(jīng)等影響,糖類、脂肪營養(yǎng)物質(zhì)刺激腸組織增加GLP-1分泌,使外周血GLP-1濃度增高,發(fā)揮“腸促胰島素”作用,并促進(jìn)胰腺葡萄糖依賴性胰島素釋放,調(diào)節(jié)體內(nèi)餐后葡萄糖達(dá)到穩(wěn)態(tài)[12-14]。本實驗開展口服糖負(fù)荷實驗,與正常對照組比較,模型組糖后血清GLP-1含量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,多穗柯總黃酮連續(xù)給藥28 d能顯著增加小鼠空腹及糖后血清的GLP-1含量(P<0.05)。表明多穗柯總黃酮通過提高分泌GLP-1基礎(chǔ)值來發(fā)揮GLP-1的降糖作用。

      L細(xì)胞是腸道分泌GLP-1的內(nèi)分泌細(xì)胞,2型糖尿病GLP-1分泌水平下降與腸道L細(xì)胞受損有關(guān)[15-16]。本實驗對腸組織進(jìn)行GLP-1免疫熒光分析,正常對照組小鼠分泌GLP-1的L細(xì)胞層連續(xù)、光滑、致密、比例高;與正常對照組比較,模型組小鼠分泌GLP-1的L細(xì)胞層斷續(xù)、疏散、比例低(P<0.01);與模型組比較,多穗柯總黃酮連續(xù)給藥28 d后,db/db小鼠分泌GLP-1的L細(xì)胞連續(xù)性較好、比例明顯增多(P<0.01)。表明多穗柯總黃酮能提高L細(xì)胞分泌GLP-1的能力,減少糖尿病小鼠L細(xì)胞的損傷。

      綜上所述,多穗柯總黃酮能顯著改善db/db小鼠多飲多食的糖尿病癥狀,降低空腹血糖值,提高空腹或餐后血清GLP-1水平,減少分泌GLP-1的腸組織L細(xì)胞的損傷,表明多穗柯總黃酮通過減少腸道L細(xì)胞損傷,保護(hù)其分泌GLP-1的功能,增加GLP-1的分泌,發(fā)揮多穗柯總黃酮防治糖尿病的作用。

      參考文獻(xiàn):

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      (收稿日期:2021-07-16)

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