山茱萸籽多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性

何坤明，王國錠，白新鵬，劉亞文，時振振，姜宗伯

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心，海南省食品營養(yǎng)與功能食品重點實驗室，海南省南海水產(chǎn)資源高效利用工程研究中心，海南 ?？?570228）

山茱萸（Cornus officinalis）是我國著名的傳統(tǒng)藥用植物，分布在中國中部，如山西、河南、湖南等省份。其果肉傳統(tǒng)上被用作滋補消炎食品，可改善肝腎功能[1]，在中醫(yī)中被用于治療糖尿病、癌癥和休克[2]。山茱萸籽是山茱萸果實留下的果仁，富含多糖、蛋白質(zhì)和油脂等成分。目前為止，山茱萸籽利用率極低，且對山茱萸籽多糖的研究報道較少。

多糖是10 個或10 個以上單糖通過糖苷鍵縮聚而成的聚合物[3]，主要存在于動植物的體內(nèi)和微生物的細胞壁中。它們分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖[4]。隨著工業(yè)的發(fā)展，多糖被廣泛應(yīng)用于食品[5]、醫(yī)藥[6]、材料領(lǐng)域[7]。幾十年來，多糖以其生物調(diào)節(jié)和生物活性吸引了生物學(xué)家，包括免疫[8]、抗氧化[9]、抗腫瘤[10]和降低血糖活性[11]。一般認為，與化學(xué)合成的抗氧化劑相比，大量的天然多糖一般具有良好的生物相容性、生物降解性和無毒性等優(yōu)點[12]。研究表明，過量活性氧引起的氧化應(yīng)激可引起多種嚴重威脅人類健康的疾病，如糖尿病、癌癥、動脈粥樣硬化、阿爾茨海默癥和帕金森氏癥[13]。據(jù)報道，天然多糖通過減少活性氧的產(chǎn)生而有利于抗氧化應(yīng)激[14]。因此，從食品工業(yè)的自然資源中發(fā)現(xiàn)和開發(fā)具有抗氧化能力的多糖具有重要意義[15]。

多糖的提取、分離和純化是研究多糖結(jié)構(gòu)和活性的基礎(chǔ)，只有得到相對純度較高的多糖組分，才能更好地分析其結(jié)構(gòu)，從而探究其重要的生理功能。多糖結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，多糖的結(jié)構(gòu)分析在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化學(xué)的核心所在。本實驗采用亞臨界水萃取技術(shù)對山茱萸籽多糖進行提取，亞臨界水是指溫度介于沸點和臨界溫度之間，維持適當(dāng)壓力使水保持為液體狀態(tài)的水[16]，作為一種新型綠色提取技術(shù)，與傳統(tǒng)水提取法[17]、超聲波輔助提取法[18]、酸堿提取法相比，亞臨界水提取法具有綠色環(huán)保、得率高、省時、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等優(yōu)點，目前在多糖、多酚、黃酮和花青素等天然產(chǎn)物提取方面得到廣泛應(yīng)用[19]。通過對山茱萸籽多糖進行分離純化、結(jié)構(gòu)特征及抗氧化性活性進行研究，旨在為山茱萸籽多糖的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。為進一步對山茱萸籽多糖開發(fā)為功能性食品及解析多糖構(gòu)效關(guān)系提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸籽購于河南南陽宛西制藥廠。

無水乙醇、質(zhì)量分數(shù)30% H2O2、葡萄糖、氫氧化鈉、氯化鈉 西隴科學(xué)股份有限公司；沒食子酸、質(zhì)量分數(shù)98%濃硫酸、苯酚 廣州化學(xué)試劑廠；福林-酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；以上試劑均為分析純。單糖標準品（甘露糖（mannose，Man）、果糖（fructose，F(xiàn)uc）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）和木糖（xylose，Xyl））（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HT-500FC型亞臨界水設(shè)備 上?；敉嶒瀮x器有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；752N型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；T27型傅里葉變換紅外光譜儀、500 MHz超導(dǎo)核磁共振光譜儀 德國布魯克公司；NW10VF型超純水系統(tǒng) 上海力康生物科技有限公司；FDU-2100型冷凍干燥機 上海埃朗科技國際貿(mào)易有限公司；1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；Verios G4掃描電子顯微鏡 美國賽默飛世爾科技公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）上海沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸籽多糖的萃取

山茱萸籽經(jīng)80 ℃干燥24 h后，研磨機研磨，過60 目篩，備用。稱取10 g山茱萸籽粉，采用亞臨界水設(shè)備萃取，萃取條件為：萃取溫度160 ℃；萃取時間20 min；料液比為1∶40（m/V）[20]。萃取完成后，用冷水快速冷卻萃取液。萃取液濃縮，8 000 r/min離心10 min，去除沉淀。上清液中加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃放置12 h后，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥，得山茱萸籽粗多糖，多糖得率（山茱萸籽多糖質(zhì)量/山茱萸籽質(zhì)量）可達（17.25±0.15）%。

1.3.2 山茱萸籽多糖脫色、脫蛋白

稱取500 mg山茱萸籽粗多糖，溶于蒸餾水中配制成5 mg/mL山茱萸籽多糖溶液，加入5 mL 30% H2O2[21]，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9，在40 ℃下水浴1 h進行脫色，6 000 r/min離心5 min得澄清透明粗多糖溶液。

脫色后的多糖溶液加入1/2體積的Sevag試劑（氯仿與正丁醇體積比為4∶1）脫除蛋白質(zhì)[22]，劇烈振蕩20 min，移入分液漏斗中靜置20 min，棄去中間蛋白層與下層物質(zhì)，多次重復(fù)上述步驟至觀察到無明顯的中間蛋白層，100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮多糖溶液至50 mL左右，裝入透析袋透析48 h，透析袋外液為500 mL蒸餾水，每隔12 h更換一次蒸餾水，從而除去多糖溶液中的鹽類及小分子雜質(zhì)。透析后將多糖溶液冷凍干燥，即可獲得山茱萸籽多糖，多糖回收率（純化后山茱萸籽多糖質(zhì)量/粗山茱萸籽多糖質(zhì)量）為（72.14±0.41）%。

1.3.3 陰離子交換柱層析分離純化山茱萸籽多糖

采用DEAE-52纖維素柱對山茱萸籽多糖進行分離純化[23]。稱取500 mg山茱萸籽多糖樣品，溶于50 mL蒸餾水中，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多糖溶液，0.45 μm過濾膜過濾，每次上樣體積5 mL，上樣至DEAE-52纖維素柱，用蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl溶液以1.0 mL/min的流速逐步洗脫。采用自動餾分收集器每管收集5 mL餾分。以葡萄糖為標準品，用苯酚-硫酸法[24]測定多糖餾分490 nm處的吸光度A490nm。合并同一吸收峰洗脫液，共得到5 個多糖組分（COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5），100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至50 mL左右，裝入透析袋透析48 h，具體方法同1.3.2節(jié)。將透析后的溶液冷凍干燥到5 個多糖組分。

1.3.4 葡聚糖凝膠柱層析純化山茱萸籽多糖組分

采用Sephadex G-100對主要餾分COSP-4進一步分離純化：層析柱規(guī)格為1.6 cm×50 cm；上樣質(zhì)量濃度10 mg/mL；上樣體積4 mL；蒸餾水洗脫，流速為0.4 mL/min；采用自動餾分收集器每管收集2 mL餾分。采用苯酚-硫酸法于490 nm波長處測定每管洗脫液的吸光度，繪制洗脫曲線，根據(jù)出峰位置收集主要餾分COSP-4，100 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮溶液至50 mL左右，裝入透析袋透析48 h，具體方法同1.3.2節(jié)。將透析后的溶液凍干得到多糖純化組分COSP-4。

1.3.5 多糖組分的純度鑒定

采用紫外光譜分析多糖組分純度，將山茱萸籽粗多糖及純化組分COSP-4分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的多糖溶液，以水作為空白對照，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，確定山茱萸籽多糖樣品特征吸收峰，同時檢測多糖組分中是否有蛋白質(zhì)及核酸殘留。

1.3.6 多糖分子質(zhì)量的測定

多糖的均一性和分子質(zhì)量測定采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法[25]，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)配備折射率檢測器和超水凝膠線性凝膠過濾色譜柱。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

將山茱萸籽多糖純化組分COSP-4和KBr按質(zhì)量比1∶40混合研磨，壓片機壓片。樣品測試前進行背景掃描去除干擾，在4 000～500 cm－1的條件下，測定多糖的有機官能團。

1.3.8 單糖組成的測定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化和LC-MS檢測分析單糖組成[26]。取10 mg樣品，用5 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）在100 ℃下水解2 h，冷卻后打開蓋，取1 mL水解后樣品溶液加入1 mL無水甲醇，70 ℃水浴下用N2吹干，如此重復(fù)加無水甲醇并用N2吹干2 次，以去除TFA；分別取400 μL的混合單糖標準溶液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中，加400 μL 0.5mol/L的PMP-無水甲醇溶液，漩渦混勻，于70 ℃水浴中反應(yīng)2 h；取出放置冷卻至室溫，加400 μL 0.3 mol/L HCl中和（pH 6～7）；加1 200 μL去離子水，再加等體積的氯仿，漩渦混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取2 次。將水相用0.45 μm微孔濾膜（水系）過濾后待進樣分析。色譜條件：色譜柱：EC-C18柱（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流動相A：20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液（pH 7.0）；流動相B：乙腈；流速0.4 mL/min；進樣量：20 μL。MS掃描條件：特征離子掃描模式；正離子模式電噴霧離子源電壓2.0 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃；脫溶劑氣（N2）流速1 000 L/h；特征離子m/z：481.09、495.1、510.1、511.08、525.06。通過比較樣品與單糖標準品色譜圖的保留時間，確定單糖組成。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察

用掃描電子顯微鏡對多糖的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。取適當(dāng)?shù)臉悠凡じ皆趻呙桦娮语@微鏡樣品盤上。用粉塵球吹走多余的樣品，并噴金，觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.10 甲基化反應(yīng)及氣相色譜-質(zhì)譜分析單糖殘基連接方式

樣品衍生化：稱取10 mg山茱萸籽多糖COSP-4樣品，加入1 mL蒸餾水溶解，加入1 mL 100 mg/mL碳二亞胺，反應(yīng)2 h。加入1 mL 2 mol/L的咪唑，將樣品平均分為2 份，分別加入1 mL 30 mg/mL的NaBH4和1 mL 30 mg/mL的NaBD4，反應(yīng)3 h，加入100 μL冰醋酸終止反應(yīng)。透析樣品48 h，透析完成后冷凍干燥樣品，進行甲基化處理。凍干樣品中加入500 μL 二甲基亞砜溶解，加入1 mg NaOH，孵育30 min，加入50 μL碘甲烷溶液反應(yīng)1 h，加入1 mL去離子水和2 mL二氯甲烷，漩渦混勻，6 000 r/min離心10 min，棄去上層水相，重復(fù)水洗3 次，吸取下層二氯甲烷相并蒸干。加入100 μL 2 mol/L TFA，121 ℃反應(yīng)90 min，30 ℃蒸干，加入50 μL 2 mol/L氨水和50 μL 1 mol/L NaBD4，混勻后室溫反應(yīng)2.5 h。加入20 μL乙酸終止反應(yīng)，氮氣吹干，250 μL無水甲醇洗兩次，氮氣吹干。加入250 μL乙酸酐，漩渦混勻，100 ℃反應(yīng)2.5 h。加入1 mL超純水靜置10 min，加入500 μL二氯甲烷，渦旋混勻，6 000 r/min離心10 min，棄水相，重復(fù)水洗3 次，取下層二氯甲烷相，上機檢測。

氣相色譜-質(zhì)譜分析（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：GC條件：進樣量為1 μL，分流比10∶1，載氣為高純氦氣；柱溫箱的初始溫度為140 ℃保持2.0 min，以3 ℃/min程序升溫至230 ℃，保持3 min；MS條件：質(zhì)譜系統(tǒng)采用的是美國Aiglent公司的四極桿質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，配有電子轟擊離子源和MassHunter工作站。采用電子轟擊離子源全掃描模式進行檢測，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：30～600。

1.3.11 核磁共振波譜分析多糖糖苷鍵的構(gòu)型

稱取50 mg樣品溶解在D2O中。使用500 MHz超導(dǎo)核磁共振光譜儀，在25 ℃記錄核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）的1H-NMR譜圖和13C-NMR譜圖。

1.3.12 DPPH自由基清除率的測定

根據(jù)文獻報道[27]稍作修改，對COSP-4的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性進行實驗分析。將溶解于乙醇中的3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液加入至2 mL不同質(zhì)量濃度（1.0～5.0 mg/mL）的COSP-4溶液中，避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度。無DPPH的反應(yīng)混合物作為對照，VC作為陽性對照。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為無樣品的反應(yīng)混合物溶液吸光度；A1為樣品與DPPH溶液的吸光度；A2為無DPPH的反應(yīng)混合物溶液吸光度。

1.3.13 羥自由基清除率的測定

取0.2 mL不同質(zhì)量濃度的COSP-4（1.0～5.0 mg/mL）與1 mL 6 mmol/L FeSO4、1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L H2O2溶液混合?；旌先芤涸?7 ℃水浴中反應(yīng)1 h，510 nm波長處測定吸光度[28]。以無H2O2溶液的反應(yīng)混合物作為對照，VC作為陽性對照。按式（2）計算羥自由基清除率。

式中：A0為無樣品的反應(yīng)混合物溶液的吸光度，A1為樣品組混合溶液吸光度，A2為無H2O2溶液的反應(yīng)混合物溶液的吸光度。

1.3.14 ABTS陽離子自由基清除率的測定

根據(jù)文獻[29]稍作修改，測定COSP-4的2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率。0.384 g ABTS和0.066 g過硫酸鉀溶解在100 mL蒸餾水中，室溫下避光反應(yīng)12 h，得到ABTS溶液。將10 mL ABTS溶液用pH 7.4 0.01 mol/L磷酸緩沖液稀釋50 倍，使734 nm波長處吸光度約為0.7。將1 mL COSP-4溶液（1.0～5.0 mg/mL）與1 mL蒸餾水和2 mL ABTS工作液混合，充分混勻后室溫避光10 min，在734 nm處測定吸光度。未加入ABTS的反應(yīng)混合物作為對照，VC作為陽性對照按公式（3）計算ABTS陽離子自由基清除率。

式中：A0為無樣品的反應(yīng)混合物溶液吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為無ABTS的反應(yīng)混合物溶液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)，以平均值±標準差表示。采用Origin 8.6軟件、MestReNova軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰離子交換柱層析分離純化山茱萸籽多糖的結(jié)果

DEAE-52纖維素柱為陰離子交換層析柱，能根據(jù)樣品所帶電荷的強弱將其分成不同的組分。由圖1可知，經(jīng)過蒸餾水和0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液進行洗脫，得到5 個多糖組分（COSP-1、COSP-2、COSP-3、COSP-4和COSP-5）。收集含量最高的多糖組分COSP-4，濃縮后透析，凍干得白色粉末，為山茱萸籽多糖初步分離純化組分COSP-4，回收率為20%左右。

圖1 山茱萸籽多糖的DEAE-52柱層析洗脫圖Fig. 1 DEAE-52 anion-exchange column chromatography elution curve of Cornus officinalis seed polysaccharides

2.2 葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果

凝膠色譜柱是根據(jù)分子質(zhì)量大小對樣品進行分離純化，分子質(zhì)量大的分子先流出色譜柱，分子質(zhì)量小的后流出，從而達到分離效果[30]。利用Sephadex G-100對經(jīng)過離子交換柱初步分離的山茱萸籽多糖COSP-4組分進行進一步的純化。

如圖2所示，用Sephadex G-100純化后的COSP-4為單峰，表明多糖樣品純度較高，為均一組分。主要餾分收集、濃縮、透析，凍干得精制的山茱萸籽多糖組分COSP-4呈白色粉末狀，回收率為70%。

圖2 COSP-4組分的Sephadex G-100柱層析洗脫圖Fig. 2 Sephadex G-100 column chromatography elution curve of COSP-4

2.3 多糖組分COSP-4的純度鑒定結(jié)果

在紫外吸收光譜圖中，溶液在200 nm～300 nm范圍內(nèi)的吸收峰可以驗證多糖中是否含大量的蛋白質(zhì)及核酸[31]，從圖3可以看出，山茱萸籽粗多糖在280 nm處有明顯的吸收峰；而COSP-4在260 nm和280 nm處無明顯的吸收峰，初步表明純化多糖COSP-4幾乎不含蛋白質(zhì)與核酸，多糖純度較高。

圖3 COSP-4組分的紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV absorption spectra of the crude polysaccharide and COSP-4

2.4 多糖分子質(zhì)量測定結(jié)果

分子質(zhì)量是多糖的重要結(jié)構(gòu)指標，影響多糖的理化和生物活性等性質(zhì)。采用HPGPC法測定COSP-4的平位均分子質(zhì)量。COSP-4的分子質(zhì)量約為2.03×104Da。峰位分子質(zhì)量（mp）為20 279 Da，重均分子質(zhì)量（mw）為17 359 Da，數(shù)均分子質(zhì)量（mn）為14 566 Da。多分散性指數(shù)（mw/mn）為1.191，接近1，說明COSP-4的平均分子質(zhì)量分布較集中，結(jié)合葡聚糖凝膠柱層析結(jié)果分析表明COSP-4純度較高。

2.5 COSP-4紅外光譜分析結(jié)果

如圖4所示，COSP-4的紅外光譜圖在3 442 cm－1附近出現(xiàn)了寬而強烈的吸收峰，表明氫鍵中存在羥基伸長[32]。在2 927 cm－1附近的吸收峰是—CH3或—CH2—的弱C－H鍵的伸縮振動所致[33]。1 637 cm－1和1 440 cm－1處的兩個峰分別是羧酸基的不對稱和對稱伸縮振動引起[34]。這證實了在COSP-4中存在糖醛酸，與單糖組成分析結(jié)果一致。同時，在1 730 cm－1附近沒有明顯的吸收峰，說明COSP-4中的葡萄糖醛酸沒有酯化[35]。1 382 cm－1處的弱吸收峰為烷基的C－H變角振動吸收峰。在1 103 cm－1附近的弱吸收峰是吡喃環(huán)骨架的C－O變角振動吸收峰，表明分子中存在C－O－H和C－O－C結(jié)構(gòu)[36]。在777 cm－1處存在弱吸收峰，推測含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，其他結(jié)構(gòu)有待進一步研究證實。

圖4 COSP-4的傅里葉變換紅外吸收光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectrum of COSP-4

2.6 單糖組成分析結(jié)果

單糖組成分析在植物多糖的結(jié)構(gòu)與功效、中藥材的檢測與鑒定等方面有著十分重要的作用[37]。實驗采用LC-MS分析COSP-4的單糖組成。

如圖5所示，Man、Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal、Xyl、Fuc出峰時間依次為5.18、6.37、7.53、7.85、8.59、9.14、9.56、10.50 min，出峰分離度較好，無干擾現(xiàn)象，可作為多糖單糖組成進一步分析的依據(jù)。通過比較標準品與COSP-4保留時間確定單糖種類，根據(jù)各峰面積比計算單糖的物質(zhì)的量之比。COSP-4是一種由6 種單糖組成的酸性多糖。由Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl組成，物質(zhì)的量比為0.96∶0.18∶5.48∶0.28∶1∶10.70，其中Xyl含量最高。

圖5 混合標準品（A）和COSP-4樣品（B）的單糖組成LC-MS圖Fig. 5 Liquid chromatograph-mass spectrometry chromatograms of mixed monosaccharide standard (A) and monosaccharide composition of COSP-4 (B)

2.7 COSP-4的微觀結(jié)構(gòu)

如圖6A所示，在5 000 倍下山茱萸籽多糖純化組分COSP-4主要是由不規(guī)則和支離破碎的結(jié)構(gòu)組成，并穿插帶有一些小的不規(guī)則顆粒，表面有碎片，為粗糙片狀。如圖6B所示，在30 000 倍下觀察到COSP-4疏松多孔，類似于海綿結(jié)構(gòu)，多糖結(jié)構(gòu)表面粗糙，結(jié)構(gòu)松散。其結(jié)構(gòu)與山茱萸果肉多糖結(jié)構(gòu)[38]較為相似，均呈不規(guī)則形狀。

圖6 COSP-4的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 SEM images of COSP-4

2.8 COSP-4單糖殘基連接方式分析結(jié)果

甲基化分析是測定多糖糖鏈中各種單糖殘基連接方式的重要手段之一。甲基化反應(yīng)是用甲基取代多糖上連接的羥基，然后完全酸水解取代后的產(chǎn)物，最后將水解產(chǎn)物進行GC-MS檢測分析，獲得不同甲基化的單糖及其比例關(guān)系。如表1所示，在COSP-4中檢測到14 種甲基化糖，結(jié)果表明山茱萸籽多糖純化組分COSP-4中含量最高單糖結(jié)構(gòu)為1,4,5-三乙?；?2,3-二甲基木糖，物質(zhì)的量分數(shù)為37.98%，其次為1,5-二乙酰基-2,3,4-三甲基木糖，物質(zhì)的量分數(shù)為18.30%。實驗對山茱萸籽多糖純化組分COSP-4鏈狀結(jié)構(gòu)主要成分進行了初步確定，為山茱萸籽多糖主鏈、側(cè)鏈的確定及三維空間結(jié)構(gòu)探索奠定一定的基礎(chǔ)。

表1 COSP-4的甲基化反應(yīng)及GC-MS分析數(shù)據(jù)Table1 Methylation reaction and gas chromatography-mass spectrometry analysis of COSP-4

2.9 COSP-4核磁共振波譜分析結(jié)果

糖苷鍵的構(gòu)型和異頭碳在多糖結(jié)構(gòu)中的構(gòu)型可用一維核磁共振（1H-NMR和13C-NMR）技術(shù)分析。1H-NMR主要用于解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵的構(gòu)型問題。一般來說，不規(guī)則質(zhì)子殘留在δ5.00以上的質(zhì)子在α構(gòu)型中有化學(xué)置換，而低于δ5.00的質(zhì)子在β構(gòu)型中有化學(xué)置換。因此，這兩種糖可以通過δ值來區(qū)分。COSP-4的一維核磁（1H和13C）光譜如圖7所示。如圖7A所示，在COSP-4的1H-NMR譜中分別出現(xiàn)6 個1H信號，分別為δ5.75、5.24、5.12、5.06、4.89、4.45，表明COSP-4中的殘基同時包含了α構(gòu)型糖基和β構(gòu)型糖基[39]，同時表明，COSP-4中有6 種糖殘基，與單糖組成及甲基化反應(yīng)對應(yīng)的GC-MS分析結(jié)果一致。

與1H-NMR相比，13C-NMR化學(xué)位移范圍寬廣，分辨率高，可以解析異頭碳的構(gòu)型，多糖殘基中取代位點和分支點。在13C-NMR波譜中，在區(qū)域內(nèi)的共振被指定為異頭碳原子。在鄰域δ101.69處有1 個異頭碳信號，屬于1 個異頭碳殘基的C1。一般來說，與α構(gòu)型連接的C1化學(xué)位移比β構(gòu)型低δ1.5～3.0，α構(gòu)型的化學(xué)位移是δ97～101，β構(gòu)型是δ103～105。從圖7B中可以看出，在COSP-4中主要存在有α構(gòu)型糖基。C2～C5信號的δ值均集中在δ70～77之間，說明其中大部分尚未被取代。在δ60～70之間都有化學(xué)位移，說明C6位置羥基一部分發(fā)生取代，一部分未發(fā)生取代。此外，δ16.57處的化學(xué)位移是由于鼠李糖的C6。

圖7 COSP-4的1H-NMR譜圖（A）和13C-NMR譜圖（B）Fig. 7 1H-NMR spectrum (A) and 13C-NMR spectrum (B) of COSP-4

2.10 COSP-4的抗氧化活性

如圖8A所示，當(dāng)COSP-4質(zhì)量濃度從0增加到3.0 mg/mL時，COSP-4對DDPH自由基的清除能力逐漸增強，當(dāng)COSP-4質(zhì)量濃度從3.0 mg/mL提高到5.0 mg/mL時，DDPH自由基的清除能力增長較為緩慢。質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時，COSP-4的DPPH自由基的清除率達到68.61%，5.0 mg/mL VC的DPPH自由基清除率高達99.60%。COSP-4和VC的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（1.72±0.14）mg/mL和（0.49±0.04）mg/mL。

圖8 COSP-4的抗氧化活性Fig. 8 Antioxidant activity of COSP-4

如圖8B所示，COSP-4對羥自由基具有一定的清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加，COSP-4清除羥自由基的能力也逐漸增強。當(dāng)質(zhì)量濃度達到1 mg/mL后，羥自由基清除率增長趨勢相對平緩。COSP-4和VC的IC50分別為（1.48±0.17）mg/mL和（0.50±0.02）mg/mL。5.0 mg/mL VC的羥自由基清除能率可達99.8%，相同質(zhì)量濃度的COSP-4羥自由基清除率為72.24%。在之前的研究報道中，在質(zhì)量濃度為21.1 mg/mL的槐根多糖中羥自由基清除率74.02%[40]，在0.3 mg/mL苦瓜多糖中，羥自由基清除率為63.92%[41]。本實驗結(jié)果表明山茱萸籽多糖COSP-4具有相對較好的清除羥自由基活性。

如圖8C所示，在質(zhì)量濃度0～5.0 mg/mL范圍內(nèi)，COSP-4對ABTS陽離子自由基的清除能力逐漸增強。COSP-4和VC的IC50分別為（2.87±0.27）mg/mL和（0.50±0.06）mg/mL。在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時，COSP-4、VC的ABTS陽離子自由基清除率分別為61.68%、99.80%。

3 結(jié) 論

本研究成功地從山茱萸籽中分離純化了一種主要的多糖組分COSP-4，并對其結(jié)構(gòu)、抗氧化活性進行了研究分析。結(jié)果表明，山茱萸籽多糖組分COSP-4是分子質(zhì)量約為2.03×104Da的酸性多糖，由Rha、GlcA、GalA、Glc、Gal和Xyl組成，物質(zhì)的量比為0.96∶0.18∶5.48∶0.28∶1∶10.70。包含14 種甲基化糖，含量最高的單糖結(jié)構(gòu)為1,4,5-三乙?；?2,3-二甲基木糖，具有良好的羥自由基、DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力，有望在天然抗氧化劑開發(fā)等方面得到應(yīng)用，同時在醫(yī)藥和功能食品中具有廣闊的應(yīng)用前景。