葉發(fā)慧，曹 東，趙彩霞，沈吉成，劉瑞娟，劉德梅，陳文杰，張懷剛

(1.中國科學院 高原生物適應與進化重點實驗室，中國科學院 西北高原生物研究所，中國科學院 種子創(chuàng)新研究院，青海 西寧 810008；2.青海省作物分子育種重點實驗室，青海 西寧 810008；3.中國科學院大學，北京 100049)

小麥品質主要包括3個方面，外觀品質、營養(yǎng)品質和加工品質，由于小麥的最終用途不同，對它的品質要求也不相同[1]。其中最重要的便是小麥的加工品質，它主要與小麥面粉加工的面團的彈性和延展性等物理特征相關[2]。影響小麥加工品質的主要因素是小麥胚乳中的儲藏蛋白。儲藏蛋白主要由醇溶蛋白、谷蛋白和 Avenin-like蛋白組成。醇溶蛋白是決定小麥面團延展性的重要因素[3]，它是通過氫鍵、分子內二硫鍵以及疏水性形成的單鏈蛋白，且無半胱氨酸殘基，可分為α、β、γ、ω 4種類型[4]。谷蛋白是通過分子間二硫鍵結合形成的高分子量線性聚合物，主要影響小麥面團的粘彈性[3-4]。Avenin-like蛋白是2006年在小麥胚乳中發(fā)現(xiàn)的一種新型儲藏蛋白，對小麥面粉的彈性有重要影響[5]，可以提高小麥面粉的加工品質。根據(jù)結構的不同，Avenin-like蛋白可分為 a型和 b 型，a 型蛋白比 b 型蛋白少1個含120個氨基酸的重復序列[5]。b 型蛋白編碼284個氨基酸，其中包含18或19個半胱氨酸殘基，在 N 端和 C 端重復區(qū)有很高的保守性[5]。

微量摻粉試驗是通過體外表達并純化得到目的蛋白，利用化學試劑將目的蛋白整合至基礎面粉，最終測定該混合面粉的品質參數(shù)來評價其對小麥品質貢獻。該方法常用于小麥谷蛋白亞基作用的評價中[6-8]，同樣也適用于Avenin-like蛋白的品質評價，魏慧等[9]將國內主栽小麥品種中的Avenin-like蛋白通過體外原核表達、純化后，進行微量摻粉試驗，證實該蛋白能有效提高面粉的加工品質；同時發(fā)現(xiàn)Avenin-like基因較為保守，在供試的國內小麥主栽品種中呈現(xiàn)很低的多態(tài)性。

節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCosson，DD，2n=2x=14)是普通小麥野生近緣物種，是普通小麥 D 染色體組的二倍體供體物種[10]。它豐富的遺傳多樣性可通過遠緣雜交導入到普通小麥中，從而改良普通小麥品種。中國科學院西北高原生物研究所麥類作物分子育種學科組前期從108份節(jié)節(jié)麥中鑒定了13個Avenin-like b基因新的變異類型，從分子層面解析了它們的核苷酸和氨基酸變異情況[11]。但是這些新變異類型對面粉加工品質的影響還不得而知。

本研究通過大腸桿菌的體外誘導表達并抽提表達蛋白進行微量摻粉試驗，評價這些源自節(jié)節(jié)麥的新型 Avenin-like b蛋白對面粉加工品質的影響。旨在鑒定優(yōu)異等位變異類型，為挑選能用于小麥優(yōu)質育種的節(jié)節(jié)麥親本提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本學科組前期鑒定的13個源自節(jié)節(jié)麥的Avenin-likeb基因(TaALPb7D-A、TaALPb7D-B、TaALPb7D-C、TaALPb7D-D、TaALPb7D-E、TaALPb7D-F、TaALPb7D-G、TaALPb7D-H、TaALPb7D-I、TaALPb7D-J、TaALPb7D-K、TaALPb7D-L、TaALPb7D-M)[11](表1)和已成功構建的重組表達載體質粒 pET32a-Avenin-likeb。

表1 13個Avenin-like b 基因及其對應NCBI登錄號Tab.1 13 Avenin-like b genes and their NCBI accession numbers

1.2 試驗方法

1.2.1 重組蛋白的蛋白誘導表達和包涵體蛋白純化 將pET32a-Avenin-likeb質粒轉化大腸桿菌BL21，挑選陽性單菌落至 3 mL LB 液體培養(yǎng)基(卡那霉素)中，37 ℃ 培養(yǎng)過夜。取菌液 100 μL 接種于 100 mL LB 液體培養(yǎng)基(卡那霉素)中振蕩培養(yǎng)過夜，取 100 mL 菌液接種于 2 000 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 擴大培養(yǎng)至OD600約 0.6，降低培養(yǎng)溫度到 30 ℃。加入 IPTG 誘導劑至終濃度0.5 mmol/L，30 ℃ 繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 3～4 h，8 000 r/min離心3 min收集菌體，重懸于50 mL預冷NTA-0緩沖液中，冰浴30 min。超聲破碎菌體，參數(shù)設置為功率200 W、工作3 s、暫停4 s、時間25～30 min，16 000 r/min 4 ℃離心50 min，收集上清以及沉淀。取少量上清及沉淀進行SDS-PAGE檢測，剩余上清及沉淀置于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂眉兓噭┖羞M行包涵體蛋白純化。

1.2.2 包涵體蛋白復性和復性蛋白純化 以2倍體積的 3 mol/L鹽酸胍稀釋蛋白溶液，在 4 ℃ 環(huán)境下以注射器逐滴加入 200 mL 復性液(pH值8.0)中，轉速調節(jié)至最大，攪拌 24 h，降低轉速，攪拌24 h。取蛋白溶液于透析袋中，用PEG 20000 濃縮體積至50～100 mL。4 ℃ 在 PBS 緩沖液透析過夜，取蛋白溶液，以 PEG 20000 濃縮體積至 2～4 mL，4 ℃ 以 PBS 緩沖液透析過夜。取蛋白溶液進行 SDS-PAGE 檢測。使用純化試劑盒進行復性蛋白純化。

1.2.3 重組蛋白的品質評價 用 10 g 微量粉質儀對重組蛋白的品質進行評價。選用青海省主栽小麥品種高原448(GY448)的面粉為基礎面粉，進行摻粉試驗，具體方法參考魏慧等[9]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel繪制圖表，用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。不同處理間的比較采用Duncan′s新復極差法(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 重組蛋白的誘導表達和純化

將重組表達載體pET32a-Avenin-likeb轉化至BL21大腸桿菌中，經(jīng)過 IPTG 誘導表達，最終在離心沉淀物的包涵體蛋白中獲得Avenin-like b 蛋白(圖1)，13個基因的蛋白表達產(chǎn)物分別命名TaALPb7D-A～M。His SUMO tag 為 16 ku，Avenin-likeb基因編碼蛋白分子量約為 32 ku，因此，重組蛋白質分子量約 48 ku。經(jīng) SDS-PAGE 檢測，重組蛋白分子量大小符合預期，Avenin-like b 蛋白成功誘導表達。

純化后的包涵體蛋白經(jīng)過滴定法復性后進行 SDS-PAGE 檢測，結果顯示只有一條帶，融合蛋白的大小正常、純度較高，可進行后續(xù)復性蛋白純化(圖1-B)。大量表達獲得的重組蛋白包涵體經(jīng)復性及 Ni-NTA 純化技術獲得重組蛋白 125 mg，純度達 85%。

2.2 重組蛋白的品質評價

由表2可知，在TaALPb7D-A～M 13個表達產(chǎn)物中，只有DTT+ KIO3處理下粉質的形成時間降低7 s，減少5.98%，而穩(wěn)定時間增加8.11%， 斷裂時間增加3.23%。其他各處理下粉質的形成時間均極顯著提高，提高了12.82%～38.46%。其中TaALPb7D-F處理下粉質的形成時間達到162 s，較GY448提高38.46%，且較各處理差異均極顯著(P<0.01)。

表2 節(jié)節(jié)麥中純化 Avenin-like b 蛋白粉質參數(shù)Tab.2 Effect of purified Avenin-like b protein on the farinograph parameters

不同處理下粉質參數(shù)的穩(wěn)定時間變化為111～160 s，較GY448各處理下蛋白質粉質的穩(wěn)定時間均提高，提高了22.52%～44.14%。其中DTT+ KIO3處理下粉質的穩(wěn)定時間提高9 s，較GY448差異不顯著(P<0.01)；其他各處理較GY448穩(wěn)定時間均極顯著提高，其中TaALPb7D-F處理下粉質參數(shù)穩(wěn)定時間為160 s，與GY448相比，穩(wěn)定時間提高44.14%，二者差異極顯著(P<0.01)。

與GY448相比，各處理下粉質斷裂時間較穩(wěn)定時間、形成時間顯著提高，提高了16.67%～20.97%。其為186～225 s，各處理下粉質的斷裂時間均增加，與GY448相比，DTT+ KIO3處理下粉質斷裂時間差異不顯著，加入TaALPb7D-A～M處理下差異均極顯著(P<0.01)。TaALPb7D-F處理下粉質斷裂時間最長為225 s，且較GY448，斷裂時間極顯著提高20.97%(P<0.01)。

由表3可知，各處理下粉質的穩(wěn)定時間變異系數(shù)最高為8.30%，穩(wěn)定時間次之為7.72%，斷裂時間變異系數(shù)最低為5.00%，說明在不同添粉處理下形成時間和穩(wěn)定時間離散度較大；而斷裂時間離散度相對較小，性狀相對穩(wěn)定。即相較于對面團斷裂時間影響的差異，不同類型的節(jié)節(jié)麥Avenin-like b蛋白對面團的形成時間和穩(wěn)定時間影響的差異會更大一些。

表3 不同處理下各參數(shù)變異情況分析Tab.3 Analysis of the variation of various parameters under different treatments

3 討論與結論

品質基因不同變異類型的功能評價，經(jīng)典的方法有基因工程法(轉基因)和多代回交構建近等基因系法。但是這2種方法在小麥中應用都比較困難，一是因為普通小麥的轉基因效率比較低，二是由于相比其他模式植物(如擬南芥)，普通小麥生長周期較長(較短時間內獲得近等基因系困難)。而且，常規(guī)的小麥面粉品質評價，需要足夠多的小麥種子來提供大量的面粉。而對于源自節(jié)節(jié)麥的Avenin-likeb基因新變異類型的品質評價，若選用上述常規(guī)方法，無疑難度還會進一步增加(涉及遠緣雜交、繁殖效率等困難)。而像本研究采用體外蛋白質微量摻粉試驗[9-12]，可在篩選到Avenin-likeb基因新變異類型之后，立刻對其進行體外原核表達，獲得微量蛋白即可初步檢測其品質特性，實現(xiàn)Avenin-likeb基因新變異類型的高通量品質評價，為優(yōu)良變異類型的高效育種利用贏得時間。

類燕麥貯藏蛋白(Avenin-like)最大特點是它們都含有較多的半胱氨酸殘基(Cys)，已報道的 Avenin-like b 普遍含有 18 個半胱氨酸[13-15]，較之前報道的小麥和燕麥貯藏蛋白都要多(麥醇溶蛋白和麥谷蛋白各自均含有不超過10個半胱氨酸殘基)。半胱氨酸殘基(Cys)是構成蛋白質分子內和分子間二硫鍵的結構基礎，二硫鍵在小麥貯藏蛋白結構連接中占有重要地位。高分子量麥谷蛋白中半胱氨酸殘基的數(shù)量和所處的位置直接影響著面粉的烘烤品質，含有優(yōu)質亞基 1Dx5 的面粉之所以比含有普通1Dx2亞基的面粉烘烤品質優(yōu)良，就是因為在 1Dx5 亞基的中央重復區(qū)前部比 1Dx2 亞基多了一個半胱氨酸殘基[16-19]。魏慧等[9]在基礎粉中加入 Avenin-like 蛋白表達純化物后，小麥面粉的形成時間顯著提高了38.46%，面團彈性顯著提升，其穩(wěn)定時間和斷裂時間也得到顯著提升。Ma等[20]通過對Avenin-like蛋白轉基因株系品質測定也得出同樣的結論。本研究結果顯示，這13個源自節(jié)節(jié)麥的 Avenin-like b 蛋白均極顯著提高小麥面粉的形成時間、穩(wěn)定時間和斷裂時間，這與前人研究結果一致[9-12]?；蛟S正是由于 Avenin-like b 蛋白中這些多達18個的半胱氨酸殘基幫助了面粉加工品質的提升。

綜上所述，與小麥基礎面粉相比節(jié)節(jié)麥中的Avenin-like b 蛋白能極顯著提高普通小麥面粉的加工品質。