鄔建飛，劉 宇，李 恒，荊 天，盧建遠，字向東

(西南民族大學(xué)，動物科學(xué)國家民委重點實驗室，四川 成都 610041)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中至關(guān)重要的細胞器，是蛋白質(zhì)合成加工及運輸?shù)闹饕獔鏊鵞1]。在氧化應(yīng)激、貧血、Ca2+穩(wěn)態(tài)紊亂等不利因素的影響下，錯誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)，產(chǎn)生未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response，UPR)[2]，從而保護細胞免受應(yīng)激危害，幫助細胞恢復(fù)穩(wěn)態(tài)[3]。研究表明，DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本3(DNA damage inducible transcript 3，DDIT3)和免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(Immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip)是ERS的代表性基因，其表達量的變化直接反映ERS程度[4]。DDIT3(又名C/EBPζ、CHOP和GADD153)與C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ和C/EBPε共同組成C/EBP蛋白家族[5]，DDIT3是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要通過促進TNFRSF10B的表達從而誘發(fā)ERS介導(dǎo)的細胞凋亡活動[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)ERS與癌癥[3]、心血管疾病[7]、糖尿病[8]、神經(jīng)性疾病[9]等多種人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)，同時，ERS在動物生殖調(diào)控方面也具有重要作用。

研究表明，ERS在雌性動物卵巢卵泡形成和卵母細胞成熟、受精、早期胚胎發(fā)育、妊娠和分娩等過程均有發(fā)生，同時，ERS的異常表現(xiàn)可能導(dǎo)致多種卵巢疾病[10]。Lin等[11]發(fā)現(xiàn)哺乳動物卵母細胞的體外成熟(invitromaturation，IVM)和胚胎培養(yǎng)(invitroculture，IVC)過程中都會發(fā)生ERS，說明ERS會影響IVM和IVC效率。Park等[12]發(fā)現(xiàn)豬卵丘-卵母細胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes，COCs)成熟培養(yǎng)44 h(MⅡ期)后DDIT3和BipmRNA表達水平顯著高于成熟培養(yǎng)22 h(MⅠ期)，而在IVM液中添加ERS抑制劑?；侨パ跄懰?TUDCA)和褪黑素則可以降低ERS，從而提高卵母細胞的成熟率。Zhao等[13]發(fā)現(xiàn)在玻璃化冷凍小鼠卵母細胞時添加TUDCA，冷凍復(fù)蘇后DDIT3基因表達下調(diào)，卵母細胞的存活率顯著提高。在小鼠和大鼠黃體期的后期DDIT3基因的表達量顯著提高，誘導(dǎo)ERS，從而引起黃體退化[14-15]。ERS還發(fā)生在早期胚胎的發(fā)育階段，在小鼠[16]、豬[12]、牛[17]等動物的囊胚階段均檢測到DDIT3的表達?；加卸嗄衣殉舶Y(PCOS)的小鼠DDIT3的表達量明顯增加[18]，卵巢儲備功能下降(DOR)患者顆粒細胞中的DDIT3mRNA表達水平顯著高于正常女性[19]。

牦牛(Bosgrunniens)主要分布在中國青藏高原及鄰近高山地區(qū)，能為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┠?、肉、燃料、役力等生活生產(chǎn)資源，素有“高原之舟”的美譽[20]。牦牛性成熟晚、季節(jié)性發(fā)情、母牦牛產(chǎn)后發(fā)情率低、加之營養(yǎng)攝入不足和管理不科學(xué)等因素，導(dǎo)致牦牛多呈現(xiàn)兩年一胎或者三年兩胎，繁殖率明顯低于其他牛類，提高牦牛繁殖效率的研究工作備受關(guān)注[21-22]。牦牛生活在高寒、低氧、高紫外線輻射等多種不利因素刺激的青藏高原，對牦牛DDIT3基因的研究不僅有助于進一步探究其在牦牛生殖過程中的作用，而且對高原動物生態(tài)適應(yīng)性及其生殖機能的調(diào)控機制也具有一定參考價值。目前，關(guān)于牦牛DDIT3基因序列、生物信息學(xué)及組織表達特性方面尚未開展過研究。本研究以牦牛作為研究對象，通過克隆測序得到牦牛DDIT3基因的序列，并對CDS區(qū)進行生物信息學(xué)分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測等。通過RT-qPCR對DDIT3基因在牦牛不同組織和不同時期生殖器官以及卵母細胞和顆粒細胞中的表達變化進行分析，為進一步探究DDIT3基因在牦牛生殖生理中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、試劑及主要儀器

本試驗樣品均采自四川省成都市青白江區(qū)屠宰場。采用頸動脈放血法處死母牦牛后采集3頭黃體期 (卵巢表面可見突出黃體)牦牛的心、肝、脾、肺、腎、卵巢、子宮和輸卵管8個組織樣，用眼科剪剪至約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小后迅速放入RNase free凍存管，置于液氮帶回實驗室保存?zhèn)溆?，再用同樣方法分別采集卵泡期(卵巢表面分布多個明顯有腔卵泡)、妊娠期(子宮角有胎兒)以及胎兒的卵巢、子宮和輸卵管組織樣。利用字向東等[23]的方法收集牦牛卵巢進行卵母細胞體外成熟(ⅣM)培養(yǎng)，分別收集GV期(0 h)、MⅠ期(12 h)和MⅡ期(24 h)卵母細胞和顆粒細胞[24]。

Single Cell-to-CtTMKit購自Invitrogen(美國)公司；TRIzol、總RNA提取試劑盒購自北京天漠科技開發(fā)有限公司；雙抗、胎牛血清(FBS)購自Gibco(美國)公司；透明質(zhì)酸酶、石蠟油購自Vitrolife(瑞典)公司；M199(10×)、17β-雌二醇(17β-E2)和丙酮酸鈉購自Sigma(美國)公司；促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)購自Bioniche(加拿大)公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DreamTaqGreen PCR Master Mix(2×)、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購自Thermo Scientific(美國)公司；DNA純化回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD19-T載體、DL-2000 Marker購自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。PCR儀(ETC811)購自蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀(CFX6)購自伯樂公司；瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)(CL1000)和恒溫培養(yǎng)箱(Class100)均購自Thermo Scientific(美國)公司；體視顯微鏡(Stemi508)購自ZEISS(德國)公司。

1.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

參照Single Cell-to-CtTMKit試劑盒使用說明提取卵母細胞和顆粒細胞的總RNA；其他組織樣總RNA用TRIzol法提取。使用紫外分光光度計檢測RNA樣品的濃度和純度，選OD260/280值在1.8～2.0備用，然后使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。根據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書將樣品RNA進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與合成

參考GenBank中野牦牛DDIT3(登錄號：XM_005901688.2)基因mRNA的預(yù)測序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計DDIT3基因的PCR引物和RT-qPCR引物；根據(jù)GenBank中牦牛的GAPDH(登錄號：EU195062.1)設(shè)計RT-qPCR內(nèi)參基因GAPDH的引物。所有引物(表1)由擎科梓熙(成都)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.4 DDIT3基因的克隆和測序

以黃體期牦牛卵巢cDNA為模板，對牦牛DDIT3基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)為25 μL體系：cDNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、DreamTaqGreen PCR Master Mix(2×)12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴增程序：預(yù)變性(94 ℃，4 min)；變性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，45 s)，延伸(72 ℃，2 min)，共38個循環(huán)；延伸(72 ℃，10 min)，最后4 ℃保存。用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，根據(jù)DNA純化試劑盒操作說明純化回收目的片段。將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接，隨后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，再均勻涂布到含Amp抗生素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落，接種到含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6 h，利用菌液PCR 鑒定陽性克隆[25]，隨后將陽性菌液送至擎科梓熙(成都)生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5 DDIT3基因的生物信息學(xué)分析

對牦牛DDIT3基因特性進行生物信息學(xué)分析，分析的具體項目和軟件見表2。

表2 生物信息學(xué)分析內(nèi)容及對應(yīng)軟件Tab.2 Bioinformatics analysis content and corresponding software

1.6 牦牛DDIT3基因的組織表達譜

采用RT-qPCR檢測DDIT3基因的表達水平，反應(yīng)體系為15 μL：上下游引物各0.5 μL、ddH2O 5.5 μL、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 7.5 μL、各組織cDNA 1 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：預(yù)變性(95 ℃，3 min)；變性(95 ℃，10 s)，退火(59.5 ℃，30 s)，共39個循環(huán)。每個樣品重復(fù)檢測3次，記錄每個樣品的Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt算法求出各組織樣的相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本試驗中的數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0軟件進行Duncan′s分析檢測不同組間的差異顯著性，其中P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著；表達差異圖利用Graphpad prism 8.02軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛DDIT3基因的克隆

分別以3頭黃體期牦牛卵巢的cDNA為模板，通過RT-PCR擴增得到與預(yù)期長度大小一致的目的片段(圖1)。通過測序得到牦牛DDIT3基因序列長度為703 bp，其中CDS區(qū)長507 bp，共編碼168個氨基酸。將cDNA序列提交至NCBI，獲得登錄號MW506292。

2.2 DDIT3基因同源性比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

利用DNAMAN將牦牛的DDIT3基因核苷酸和DDIT3蛋白質(zhì)氨基酸與其他物種進行同源性比對(表3)，核苷酸比對結(jié)果顯示，牦牛與野牛序列相似度高達99.71%，其次是普通牛，相似性為99.58%；氨基酸序列比對結(jié)果顯示，牦牛與野牛和普通牛的相似性高達100%，其次是水牛，序列相似度為99.40%，同時發(fā)現(xiàn)與表中其他物種的核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均在88%以上，說明DDIT3基因在物種進化中具有高度保守性。

表3 牦牛和其他物種DDIT3基因和氨基酸序列的同源比對Tab.3 DDIT3 nucleotide and deduced amino acid identities in yaks compared to other species %

為了進一步研究牦牛DDIT3基因的進化過程，利用MEGA 7.0構(gòu)建牦牛DDIT3基因的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示(圖2)，牦牛首先與野牛聚為一類，說明牦牛DDIT3基因與野牛親緣關(guān)系最近，這也間接證明牦牛在分類學(xué)上與野牛更接近；其次與普通牛、水牛、山羊、綿羊、羊駝聚為一類，這些動物都屬于反芻動物；再與馬、人、黑猩猩、狗、大熊貓聚為一類；最后與穿山甲聚為一類，與牦牛DDIT3基因親緣關(guān)系最遠的是穿山甲，說明該基因的進化符合物種的進化規(guī)律。

2.3 牦牛DDIT3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測

利用ExPASy Protparam tool在線軟件對牦牛DDIT3的氨基酸序列進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)分子式為C804H1286N240O283S5，分子質(zhì)量為19.00 ku；脂肪族系數(shù)為55.83、不穩(wěn)定系數(shù)為87.84、親水性總平均值為-1.137、理論等電點為4.78、估計半衰期為30 h、消光系數(shù)為18 115；DDIT3蛋白一共包含20種氨基酸，其中含量最高的是谷氨酸(Glu)，其次是絲氨酸(Ser)，占比分別為17.3%,11.3%，其他氨基酸含量均低于10%，帶負電荷(Asp+Glu)的氨基酸殘基總數(shù)和帶正電荷(Arg+Lys)的氨基酸殘基總數(shù)分別為34和22。因此，可以推斷DDIT3蛋白屬于酸性不穩(wěn)定親水蛋白。

利用NetPhos 3.1預(yù)測牦牛DDIT3的磷酸化位點，結(jié)果顯示，其包含24個磷酸化位點，其中包含18個絲氨酸(Ser)磷酸化位點、5個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和1個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(圖3)；利用NetOGlyc 4.0預(yù)測牦牛DDIT3的糖基化位點，結(jié)果顯示，其包含14個糖基化位點，其中包含12個O-糖基化位點和2個N-糖基化位點。蛋白質(zhì)的亞細胞定位顯示，DDIT3蛋白主要存在于細胞核(43.5%)和細胞質(zhì)(30.4%)內(nèi)，其次是細胞骨架(17.4%)和線粒體(8.7%)。

2.4 牦牛DDIT3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測

通過線上軟件對DDIT3的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，DDIT3蛋白中α-螺旋占比51.19%、無規(guī)則卷曲占比48.81%，不具有β-轉(zhuǎn)角、跨膜結(jié)構(gòu)、胞外結(jié)構(gòu)、無序結(jié)構(gòu)、信號肽序列等結(jié)構(gòu)(圖4-A)。三級結(jié)構(gòu)(圖4-B)與二級結(jié)構(gòu)相吻合，牦牛DDIT3蛋白含有CDC45和bZIP 2個保守蛋白功能結(jié)構(gòu)域，其中CDC45是釀酒酵母中啟動DNA復(fù)制所必需的基因，堿性亮氨酸拉鏈因子(bZIP)是一類重要的增強子類轉(zhuǎn)錄因子(圖4-C)。

2.5 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖分析

通過STRING線上分析軟件對牦牛DDIT3蛋白進行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，結(jié)果顯示，與DDIT3互作緊密的蛋白有ATF4、ATF6、XBP1、HSPA5、ATF3、BCL2L11，它們的相關(guān)性系數(shù)分別是0.990，0.978，0.978，0.946，0.932，0.928(圖5)。其中ATF4能促進天冬酰胺合成酶(ASNS)的合成，與DDIT3協(xié)同作用；ATF6是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白水解后，它通過編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶基因啟動子中的順式作用元件，從而發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄因子的作用；XBP1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)未折疊的蛋白反應(yīng)；HSPA5在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)部多聚體蛋白復(fù)合物的組裝中發(fā)揮重要作用，主要參與蛋白質(zhì)的正確折疊和錯誤折疊蛋白質(zhì)的降解；ATF3與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合，抑制含有ATF位點的啟動子的轉(zhuǎn)錄；BCL2L11屬于BCL-2蛋白家族，起到凋亡激活劑的作用。

2.6 DDIT3基因組織表達分析

以子宮中DDIT3基因的相對表達量作為參考，利用RT-qPCR技術(shù)對牦牛心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、輸卵管、卵巢和子宮中DDIT3基因mRNA的表達水平進行檢測。結(jié)果顯示，DDIT3在這8個組織樣中均有表達，其中在卵巢組織表達量最高，極顯著高于其他組織樣(P<0.01)，其次表達量較高的是子宮和腎臟，子宮的相對表達量極顯著高于脾臟(P<0.01)，其他組織樣中DDIT3的表達差異不顯著，在所檢測的組織中，脾臟的表達量最低(圖6)。

以黃體期DDIT3基因的相對表達量作為參照，利用RT-qPCR檢測牦牛不同時期卵巢、子宮和輸卵管3個組織中DDIT3基因mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，妊娠期卵巢中DDIT3mRNA表達量最高，顯著高于其他3個時期(P<0.05)，表達量較高的是黃體期卵巢，顯著高于胎牛(P<0.05)(圖7-A)；在子宮中，DDIT3表達較高的是妊娠期，妊娠期顯著高于卵泡期和胎牛(P<0.05)，卵泡期和胎牛的表達差異不顯著(圖7-B)；在輸卵管中，DDIT3mRNA各時期表達差異不顯著(圖7-C)。

2.7 卵母細胞及顆粒細胞中DDIT3基因的表達

以MⅡ期DDIT3基因的相對表達量作為參照，利用RT-qPCR對GV期、MⅠ期、MⅡ期卵母細胞和顆粒細胞中DDIT3基因的相對表達量進行分析。結(jié)果表明，MⅡ期卵母細胞DDIT3基因的相對表達量顯著高于GV期和MⅠ期(P<0.05)，而GV期與MⅠ期間的相對表達量差異不顯著(圖8-A)；MⅡ期顆粒細胞中DDIT3的相對表達量顯著高于GV期和MⅠ期(P<0.05)，但GV期和MⅠ期差異不顯著(圖8-B)，卵母細胞和顆粒細胞中DDIT3的相對表達變化趨勢一致。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是真核生物中最大的細胞器之一，主要參與蛋白質(zhì)折疊和成熟分泌、維持Ca2+穩(wěn)態(tài)、磷脂合成等[2]。在葡萄糖不足、缺氧、Ca2+失衡和游離脂肪酸升高等生理或病理條件下會導(dǎo)致錯誤折疊蛋白質(zhì)在ER中積累，進而誘導(dǎo)ERS的發(fā)生[3]。ERS包括PERK/eIF2α、IRE1α/XBP1和ATF6α 3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，研究證明，這3條途徑最終均可誘導(dǎo)DDIT3基因的表達，從而促進細胞內(nèi)凋亡過程的發(fā)生[26]。研究發(fā)現(xiàn)，DDIT3基因在小鼠[16]、牛[17]、豬[12]等動物生殖過程中處于動態(tài)的變化過程，其在動物生殖活動中起著重要的調(diào)控作用。牦牛是生活在高寒、低氧地區(qū)的特有畜種，但關(guān)于牦牛DDIT3基因及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能尚未見報道，本研究克隆出牦牛DDIT3基因，對其編碼蛋白質(zhì)的功能和理化性質(zhì)進行預(yù)測，并分析了該基因的組織表達特性及其在卵母細胞發(fā)育與成熟過程中的表達情況。

本研究成功克隆出牦牛DDIT3基因，通過測序得到其完整的CDS區(qū)，在核苷酸序列比對和氨基酸序列比對中發(fā)現(xiàn)牦牛與野牛的同源性分別99.71%，100.00%，基因系統(tǒng)進化樹上牦牛與野牛單獨聚為一支，說明牦牛DDIT3基因的同源性與野牛最高，佐證了李齊發(fā)等[27]、郭松長等[28]認為牦牛與野牛的遺傳相似性更高、親緣關(guān)系更近的觀點，為牦牛在牛亞科中的分類提供參考；在與其他物種核苷酸序列比對時發(fā)現(xiàn)DDIT3基因表現(xiàn)出物種間高度相似，說明DDIT3基因在物種進化中表現(xiàn)出高度保守。對牦牛DDIT3蛋白序列預(yù)測發(fā)現(xiàn)其含量最高的氨基酸是谷氨酸，占比17.3%，谷氨酸是下丘腦主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[29]，它能與GnRH神經(jīng)元末梢發(fā)生反應(yīng)從而促進GnRH的分泌，進而促進垂體合成釋放LH和FSH[30]。RT-qPCR結(jié)果顯示處于黃體期的卵巢、輸卵管、子宮中DDIT3的相對表達量均比卵泡期高，這可能與DDIT3的表達促進黃體期后期黃體細胞凋亡、黃體退化有關(guān)[15]。DDIT3蛋白的亞細胞定位顯示其主要存在于細胞核和細胞質(zhì)，說明DDIT3蛋白在細胞的遺傳和代謝過程中起著重要作用。通過蛋白互作圖可以發(fā)現(xiàn)與DDIT3聯(lián)系緊密的蛋白有ATF4、ATF6、XBP1、ATF3、BCL2L11等，這與DDIT3的作用途徑緊密關(guān)聯(lián)。細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白累積導(dǎo)致PERK中的Bip釋放，促進真核細胞中eIF2α磷酸化，eIF2α的磷酸化使錯誤蛋白失活，在另一途徑中ATF4被同時激活，它與轉(zhuǎn)錄因子DDIT3結(jié)合發(fā)生作用，使行使完功能的eIF2α去磷酸化，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)到正常狀態(tài)，ATF4還會促使ATF3表達[26]；Bip的釋放也使ATF6由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體中，由Site-1(S1P)和Site-2(S2P)剪接處理得到活性變體ATF6 p50，活性變體ATF6 p50轉(zhuǎn)運到細胞核后可以促進DDIT3和抑制抗凋亡因子Mcl-1的表達來調(diào)節(jié)細胞凋亡[2]；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，IRE1α被磷酸化激活，激活的IRE1α剪切編碼XBP-1 mRNA內(nèi)含子得到XBP-1剪接變異體(sXBP-1)，sXBP-1誘導(dǎo)p58IPK表達從而抑制PERK活性以控制UPR反應(yīng)，間接控制DDIT3的表達[3]，本試驗中牦牛DDIT3蛋白互作圖說明了ERS 3條調(diào)節(jié)途徑的緊密聯(lián)系。

本試驗RT-qPCR結(jié)果顯示，卵巢中DDIT3基因相對表達量極顯著高于其他組織，然后表達量較高的是子宮，在脾臟中表達量最低，這與人DDIT3基因的組織表達情況基本一致[31]。卵巢具有生殖(負責(zé)卵母細胞的發(fā)育成熟和排出以供受精)和激素(如雌激素、孕激素和雄激素)合成分泌的雙重作用[32]；子宮是早期胚胎附植、發(fā)育的場所，還具有調(diào)節(jié)卵巢功能、促進發(fā)情等功能[33]。DDIT3基因在卵巢和子宮中的高表達說明母牦牛卵巢和子宮在發(fā)情周期中各種細胞的增殖與凋亡比其他組織活躍。研究證明，進入卵泡期之后卵母細胞生長速率逐漸增加，這可能導(dǎo)致細胞處于低氧狀態(tài)[34]，這種局部環(huán)境的變化可能會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，進而導(dǎo)致未折疊和錯誤折疊的蛋白質(zhì)積聚，從而引起ERS[35]。Lin等[36]在山羊閉鎖卵泡的顆粒細胞中檢測到DDIT3蛋白，非閉鎖卵泡未檢測到DDIT3蛋白，說明DDIT3通過ERS通路參與了卵母細胞的閉鎖調(diào)控；ERS還與黃體的退化密切相關(guān)，Park等[37]發(fā)現(xiàn)牛和小鼠[17]的黃體期卵巢中ERS 3條信號通路均被激活，DDIT3的表達呈升高趨勢，本試驗也發(fā)現(xiàn)黃體期卵巢中DDIT3的相對表達量高于卵泡期和胎兒卵巢。本試驗還發(fā)現(xiàn)妊娠期卵巢中DDIT3的相對表達量顯著高于胎兒、卵泡期、黃體期卵巢，這說明妊娠刺激卵巢中DDIT3的高表達誘導(dǎo)卵泡ERS，從而抑制妊娠期卵巢卵泡的發(fā)育。Lin等[38]研究發(fā)現(xiàn)小鼠懷孕第5天開始，子宮中Bip表達明顯上調(diào)，說明胎兒著床誘發(fā)了ERS，而Liu等[39]發(fā)現(xiàn)子宮ERS的持續(xù)高水平表達可能是造成早期胚胎流產(chǎn)，本試驗RT-qPCR結(jié)果顯示，妊娠期子宮DDIT3的相對表達量高，說明在高寒、低氧、營養(yǎng)匱乏的高原環(huán)境條件下，妊娠期牦牛的子宮也處于ERS狀態(tài)，可能導(dǎo)致母牦牛在冬春季節(jié)流產(chǎn)率高。

卵母細胞與顆粒細胞間的作用密不可分，顆粒細胞可以誘導(dǎo)卵母細胞發(fā)生減數(shù)分裂，促進細胞質(zhì)成熟；同時卵母細胞在顆粒細胞的成熟和分化中起著重要調(diào)控作用[40]。本試驗RT-qPCR結(jié)果顯示，DDIT3基因在牦牛各階段卵母細胞和顆粒細胞中均有表達，但相對表達量存在差異。MⅡ期卵母細胞和顆粒細胞中DDIT3的相對表達量都顯著高于GV期和MⅠ期，GV期和MⅠ期中DDIT3的表達差異不顯著，這與Park等[12]在豬上的研究結(jié)果類似，本試驗中卵母細胞和顆粒細胞DDIT3基因的表達變化趨勢呈現(xiàn)出一致性。卵母細胞在成熟過程中代謝速率加快，這會導(dǎo)致卵母細胞內(nèi)源性活性氧(ROS)增加從而出現(xiàn)氧化應(yīng)激[41]，ERS與氧化應(yīng)激通常同時存在，氧化應(yīng)激的存在會加快卵母細胞的衰老[42]。Zhang等[43]在培養(yǎng)基中添加50 μmoL 的TUDCA可以顯著提高豬GV期、MⅠ期和MⅡ期卵母細胞的成熟率；Zhao等[13]也發(fā)現(xiàn)在玻璃化冷凍小鼠卵母細胞時添加TUDCA可以顯著提高小鼠卵母細胞的存活率；Park等[12]發(fā)現(xiàn)可以通過褪黑素來減少體外成熟過程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而改善豬卵母細胞減數(shù)分裂；楊方曉等[44]研究在培養(yǎng)基中添加HT-2毒素培養(yǎng)12 h會促進牛顆粒細胞中DDIT3的表達從而誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，再添加褪黑素培養(yǎng)12 h后發(fā)現(xiàn)DDIT3的表達下調(diào)，說明顆粒細胞中ERS得到緩解?；谇叭搜芯靠梢园l(fā)現(xiàn)，DDIT3基因在卵母細胞減數(shù)分裂過程中表達上調(diào)可能對卵母細胞成熟以及早期胚胎的發(fā)育造成不良影響，但可以通過添加外源ERS抑制劑來改善這種情況，這為提高牦牛卵母細胞體外成熟效率提供了啟示。

本研究成功克隆出牦牛DDIT3基因并通過測序獲得其完整的CDS區(qū)，核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)牦牛DDIT3基因與野牛最接近，在進化過程中表現(xiàn)出高度保守；DDIT3基因在牦牛各組織中均有表達，其中在卵巢和子宮中的相對表達量較高，在妊娠期和黃體期的卵巢和子宮中表達較高，在MⅡ期卵母細胞和顆粒細胞中表達較高。說明DDIT3可能在維持母牦牛卵巢機能與妊娠以及卵泡發(fā)育與成熟過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，該研究結(jié)果對于研究動物對高寒低氧環(huán)境的適應(yīng)性及其對生殖機能的影響也具有一定參考價值。