基于小RNA技術(shù)的天津地區(qū)番茄花葉病毒分子檢測與基因組部分序列分析

金鳳媚，薛 俊，孫海波，郝志愚

(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300192)

番茄(LycopersiconesculentumMill.)在我國種植面積較大，在保證蔬菜供應(yīng)上占有重要地位。近年來，在番茄產(chǎn)區(qū)，番茄病毒病發(fā)生嚴(yán)重，在天津地區(qū)發(fā)生的主要病毒病有番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)、番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus，ToCV)、番茄斑萎病毒(Tomatospottedwildvirus，TSWV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus，ToMV)等[1-3]。

ToMV為正義單鏈RNA病毒，屬于帚狀病毒科(Virgaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)。基因組共有4個(gè)開放閱讀框，分別編碼外殼蛋白(Coat Protein，CP)、運(yùn)動(dòng)蛋白(Movement Protein，MP)以及與復(fù)制相關(guān)的126 ku蛋白和183 ku蛋白[4]。由于ToMV與煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)親緣關(guān)系很近，所以在早期報(bào)道中，將ToMV稱為TMV番茄分離物[5]。近年來，鑒于ToMV和TMV在生物學(xué)、血清學(xué)和核酸序列等方面的不同，ToMV被作為一種獨(dú)立的病毒進(jìn)行研究[6]。ToMV的寄主很多，番茄是該病的主要寄主。ToMV侵染番茄后葉片出現(xiàn)花葉病狀，有的還會(huì)導(dǎo)致葉片變形，植株矮縮，甚至死亡。果實(shí)會(huì)出現(xiàn)著色不均，或出現(xiàn)凹陷的褐色病斑[7]。

近年來，天津市西青區(qū)和寶坻區(qū)的部分番茄產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了疑似番茄花葉病毒引起的醬油果。由于其表現(xiàn)非常類似于由低溫引起的番茄轉(zhuǎn)色不良而產(chǎn)生的醬油果，導(dǎo)致很多農(nóng)戶錯(cuò)誤地采取噴施營養(yǎng)肥和提高棚室地溫的措施，病株也未見明顯好轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響了番茄果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量。因此，明確這種番茄病的病原已迫在眉睫。

本研究利用小RNA 深度測序及RT-PCR 技術(shù)對(duì)天津地區(qū)番茄病株樣本進(jìn)行了病原的分子鑒定及基因組序列分析，旨在明確引起該病的病原，同時(shí)為該病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年5-6月份在天津市西青區(qū)和寶坻區(qū)日光溫室番茄栽培田中，采集發(fā)病的番茄果實(shí)樣本，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，用于RNA提取及后續(xù)試驗(yàn)。

菌株與載體：大腸桿菌DH5α，T-easy 載體均購自寶生物工程有限公司。

試劑：RNA提取試劑、RNase Inhibitor、M-MLV均購自寶生物工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小RNA深度測序 對(duì)所采集的番茄果實(shí)的小RNA進(jìn)行測序。2020年5月選取10株顯癥植株并各自采1個(gè)果實(shí)。從每個(gè)果實(shí)的發(fā)病部位各取0.1 g 組織，然后進(jìn)行混合，提取混合樣小RNA。利用試劑盒(Small RNA Sample Pre Kit，Illumina公司)構(gòu)建文庫，然后利用測序儀(Illumina HiSeq4000)進(jìn)行深度測序，除雜后利用軟件(Velvet assembler)獲得拼接序列(Contigs)，將拼接序列與NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nig.gov)病毒數(shù)據(jù)庫中的已知病毒基因組序列進(jìn)行比對(duì)，初步判斷樣品中病毒的種類。上述測序及分析工作委托上海伯豪基因科技有限公司完成。

1.2.2 RT-PCR驗(yàn)證 根據(jù)陳利達(dá)等[8]設(shè)計(jì)的引物檢測TMV，廖富榮等[9]設(shè)計(jì)的檢測ToMV的引物，陳靈芝等[10]設(shè)計(jì)的引物檢測番茄斑駁病毒(Tomatomottlevirus，ToMMV)(表1)。利用RT-PCR對(duì)小RNA測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。采用TRIzol試劑提取番茄感病果實(shí)的總RNA，以其為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為：模板RNA 1 μL，Random引物1 μL，dNTP 0.5 μL，用DEPC處理水補(bǔ)足10 μL。65 ℃變性5 min，迅速置于冰上2 min，離心后，加入下列試劑：5×M-MLV Buffer 5 μL，RTaseM-MLV 1 μL，RNAase Inhibitor 0.5 μL，總體積10 μL。先用30 ℃保溫10 min，然后42 ℃保溫60 min，最后70 ℃保溫15 min。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T-easy載體，由TaKaRa公司完成測序。對(duì)10 株田間樣品進(jìn)行檢測，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小以及測序結(jié)果鑒定樣品中的病毒種類。

表1 病毒 RT-PCR 檢測引物Tab.1 Primers for RT-PCR detection

1.2.3 ToMV天津分離物(ToMV-TJ)全基因組序列 取受侵染的番茄病株果實(shí)，抽提總RNA，以美國分離物(USA_99-1)(GenBank：KR537870.1)基因組序列為參照，參考隋雪蓮[11]設(shè)計(jì)的部分引物，共設(shè)計(jì)9對(duì)覆蓋全基因組的PCR引物(表2)，采用RT-PCR法獲得病毒基因組擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)體系同上所述，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T-easy載體上后由TaKaRa公司完成測序。利用 DNAStar 軟件對(duì)上述9對(duì)引物擴(kuò)增所得產(chǎn)物序列進(jìn)行拼接。

表2 ToMV-TJ全基因組擴(kuò)增用到的PCR引物Tab.2 Primers for determination of ToMV-TJ genomic sequence

1.2.4 序列分析 利用Blast(www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST/)進(jìn)行序列比較，利用MEGA 5.05進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，利用DNAStar進(jìn)行序列相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病株的癥狀

番茄植株感病后主要表現(xiàn)為果實(shí)表面有醬油色斑塊，病斑大小不一，一般呈圓形。多從果肩開始發(fā)病，初期斑塊顏色淡，后期病斑變?yōu)榘岛稚磷睾稚?，邊緣明顯，微凹陷。植株葉片和莖植無明顯癥狀。植株感病后期坐果減少(圖1)。

2.2 小RNA深度測序檢測番茄樣品中病毒種類

對(duì)感病番茄的果實(shí)進(jìn)行高通量測序，獲得Raw reads共81 133 750條，去除不合格reads，得到Clean reads共79 534 404條。利用Velnet軟件將測序獲得的小RNA拼接組裝成病毒的Contigs，經(jīng)與GenBank中報(bào)道的病毒序列進(jìn)行比對(duì)，其中5條比對(duì)到ToMMV，114條比對(duì)到ToMV，8條比對(duì)到TMV。測序結(jié)果初步表明，混合樣品中可能含有以上3種病毒。

2.3 利用RT-PCR對(duì)小RNA測序結(jié)果的驗(yàn)證

利用檢測ToMMV、ToMV和TMV 3種病毒的特異引物(表1)，對(duì)感病果實(shí)進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果表明，利用檢測ToMV和ToMMV特異引物To-F/R和spe-F/R均能從感病果實(shí)中擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物(圖 2)。而檢測TMV的特異引物不能擴(kuò)增到預(yù)期產(chǎn)物，初步判斷病原可能為ToMV和(或)ToMMV。利用表2中的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果利用Blast進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與ToMV美國99-1分離物的相似性均在98%以上，證明引起番茄果實(shí)壞死斑癥狀的病原為ToMV。

2.4 番茄花葉病毒天津分離物序列測定及分析

利用ToMV-F1/R1～ToMV-F9/R9引物，對(duì)病樣進(jìn)行RT-PCR檢測，均得到目的條帶(圖3)，將目的條帶克隆并測序，組合后得到了ToMV-TJ的全基因組序列，提交至 GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為MW042871。序列分析表明，ToMV-TJ全序列共6 383個(gè)核苷酸，有4個(gè)開放閱讀框，分別編碼126 ku的復(fù)制酶相關(guān)蛋白，183 ku的蛋白(由126 ku蛋白通讀產(chǎn)生，與病毒復(fù)制有關(guān))，運(yùn)動(dòng)蛋白和外殼蛋白，這與其他地區(qū)的ToMV基因組結(jié)構(gòu)一致。

利用Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)天津地區(qū)發(fā)生的ToMV基因組部分序列進(jìn)行比對(duì)。在眾多比對(duì)結(jié)果中，選擇了一些具有代表性的分離物序列進(jìn)行同源性的分析。這些序列為國內(nèi)已報(bào)道番茄花葉病毒分離物以及世界不同地區(qū)有代表性的分離物(表3)。

表3 其他ToMV毒株來源Tab.3 Other sources of ToMV strains

利用MEGA 5.05軟件對(duì)CP蛋白的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖4)。結(jié)果表明，大部分分離物形成一個(gè)大分支，證明這些分離物的CP蛋白進(jìn)化關(guān)系很近，該蛋白很保守。天津分離物(ToMV-TJ)與美國(USA_99-1)和墨西哥(Mexico_M4)分離物關(guān)系最近。與斯洛伐克(Slovakia_SL-1)分離物的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。該進(jìn)化關(guān)系圖部分地區(qū)體現(xiàn)出病毒的區(qū)域相似性，如哈薩克斯坦的2個(gè)分離物(Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2)和越南的2個(gè)分離物(Viet_Nam_BaoLoc、Viet_Nam_chili)，以及中國臺(tái)灣China_Taiwan_Penghu)、內(nèi)蒙古(China_Neimenggu)、杭州(China_Hangzhou)分離物分別聚在了一起。

對(duì)該基因的運(yùn)動(dòng)蛋白基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖5)。結(jié)果表明，與CP蛋白基因類似，天津分離物(ToMV-TJ)與美國(USA_99-1)和墨西哥(Mexico_M4)分離物和埃及(Egypt_AH4)關(guān)系最近。大部分分離物形成一個(gè)大分支，只有英國分離物(UK_FERA)的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。同樣地，該進(jìn)化關(guān)系圖部分地區(qū)

體現(xiàn)出病毒的區(qū)域相似性，如哈薩克斯坦的2個(gè)分離物(Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2)，中國新疆(China_Xinjiang)和杭州(China_Hangzhou)，越南的2個(gè)分離物(Viet_Nam_BaoLoc、Viet_Nam_ chili)，以及地理距離很近的斯洛文尼亞(Slovenia_WW17-I-f16-18-Nocc-pos2 )和斯洛伐克(Slovakia_SL-1)分別聚在了一起。

與前2個(gè)蛋白類似，126蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明(圖6)，大部分的分離物都形成了一個(gè)大分支，天津分離物(ToMV-TJ)與美國分離物(USA_99-1)的進(jìn)化關(guān)系最近。同樣地，該進(jìn)化關(guān)系圖部分地區(qū)體現(xiàn)出病毒的區(qū)域相似性，如中國新疆(China_Xinjiang)、中國杭州(China_Hangzhou)、中國山東(China_Shangdong)分離物聚在一起；哈薩克斯坦的2個(gè)分離物(Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2)聚在一起。

2.5 相似性分析

為進(jìn)一步了解ToMV-TJ分離物與國內(nèi)外其他地區(qū)分離物的序列相似性，利用DNAStar ClustralW軟件進(jìn)行了相似性分析(表4)。其中，CP蛋白基因與越南的分離物(Viet_Nam_chili)的相似性最低為79.8%，與美國(USA_99-1)的分離物相似性最高為99.8%。與其他CP蛋白基因分離物的平均相似性為95.53%。該基因編碼的蛋白與哈薩克斯坦K2分離物(Kazakhstan_K2)的相似性最低為96.6%，與美國(USA_99-1)的分離物、中國新疆(China_Xinjiang)、中國山東(China_Shandong)、埃及(Egypt_AH4)、墨西哥(Mexico_M4)、韓國(South Korea_GW2)、烏干達(dá)(Uganda_ToMV0Ug)、越南(Viet_Nam_Baoloc)、英國(UK_FERA)相似性最高為100%。與其他地區(qū)分離物的平均相似性為99.10%。

表4 ToMV-TJ分離物與其他國家和地區(qū)分離物的相似性分析Tab.4 The identities of ToMV-TJ isolate with reference ToMV in different country and regions %

MP蛋白基因與越南的分離物(Viet_Nam_chili)的相似性最低為75.8%，與美國(USA_99-1)的分離物相似性最高為99.8%。與其他MP蛋白基因分離物的平均相似性為95.21%。該基因編碼的蛋白與中國北京的分離物(China_Beijing)的相似性最低為98.5%，與美國(USA_99-1)等大部分的分離物(Australia_Queensand、China_Neimenggu、China_Shandong、China_Xinjiang、China_Hangzhou、Egypt_AH4、Germany_ToMV1-2、Japan_L11Y、Japan_Fukushima、Kazakhstan_K1、Kazakhstan_K2、Mexico_M4、South Korea_ GW2、Uganda_ToMV-Ug、Viet_Nam_Baoloc、Viet_Nam_chili)相似性為100%。平均相似性為99.26%。

126蛋白基因與越南的分離物(Viet_Nam_chili)的相似性最低為64.6%，與中國山東(China_Shandong)的分離物相似性最高為99.7%。與其他126蛋白基因分離物的平均相似性為92.72%。該基因編碼的蛋白與中國北京的分離物(China_Beijing)的相似性最低為99.00%，與美國99-1等其他的分離物的相似性在99.0%～99.7%，平均相似性為99.0%。

對(duì)CP、MP和126蛋白3個(gè)基因和蛋白相似性分析表明，這3個(gè)基因在核苷酸水平的保守性CP蛋白最強(qiáng)，MP次之，126蛋白最弱。而在蛋白水平MP最強(qiáng)，CP次之，126蛋白最弱，相似性平均在99.0%以上，且蛋白的平均相似性大于核苷酸的平均相似性。這說明ToMV編碼的這3個(gè)蛋白在全世界范圍內(nèi)的變異頻率不是很高，保守性很強(qiáng)，而且該病毒的基因變異大部分屬于無義突變。

3 討論

Small RNA測序技術(shù)已在植物病毒鑒定中得到廣泛應(yīng)用[12-13]。本研究應(yīng)用該技術(shù)對(duì)天津地區(qū)發(fā)生的番茄果實(shí)褐化的病原檢測出3種病毒。進(jìn)一步結(jié)合RT-PCR和測序技術(shù)確定該病為ToMV引起，而不是一種生理性病害，這為今后的該病防治提供了理論依據(jù)。

3.1 天津地區(qū)ToMV的序列分析

本研究中，對(duì)該病毒的外殼蛋白CP和運(yùn)動(dòng)蛋白MP以及編碼的126蛋白進(jìn)行了克隆和序列分析。通過分析可以看出，天津地區(qū)的病毒分離物與空間距離較遠(yuǎn)的美國、墨西哥分離物同源關(guān)系較近。這在一定程度上說明，此病毒的天津分離物可能是由于貿(mào)易活動(dòng)隨種子或種苗從國外帶到本地，并進(jìn)行了為害。廖富榮等[9]報(bào)道在進(jìn)口的番茄種中檢測出ToMV。番茄花葉病毒雖然在我國很多地方均有報(bào)道[3，14-16]，但是各地發(fā)生的情況和癥狀不盡相同，致病的病原可能為不同的病毒株系。因此，在番茄種苗調(diào)運(yùn)時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)檢疫，避免該病毒隨著番茄種苗在不同地區(qū)的調(diào)運(yùn)，加速該病毒的廣泛傳播。

3.2 ToCV的發(fā)生和防治

近年來，在天津地區(qū)的番茄上發(fā)生的2個(gè)主病毒病為TYLCV和ToMV[1-2]。自1909年美國首次報(bào)道ToMV的發(fā)生以來，該病已廣泛分布于世界各國的番茄生產(chǎn)區(qū)，在中國很多地方也有嚴(yán)重發(fā)生[7，17]。對(duì)該病的防治主要是利用抗病基因進(jìn)行育種。已有研究表明，針對(duì)TMV的抗性基因Tm-2和Tm-22對(duì)ToMV有原始抗性[18-19]，生產(chǎn)上很多番茄品種含有這些基因。因?yàn)門oMV是一個(gè)為害番茄很多年的老病害，很多品種含有對(duì)該病害的抗性基因(Tm-22)，所以，沒有對(duì)病情進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，造成了損失。筆者在番茄品種選育過程中也發(fā)現(xiàn)有很多含有Tm-22基因的材料，也能引起病毒的侵染。這可能是因?yàn)椴《净虮旧戆l(fā)生了變異，從而突破了寄主的抗性。對(duì)于上述推測，還需通過構(gòu)建突變體試驗(yàn)、侵染性克隆接種試驗(yàn)等予以驗(yàn)證。近年來，對(duì)于ToMV的防治也有一些其他有益的嘗試，如利用納米氧化鋅增強(qiáng)番茄植株免疫力，提高了番茄對(duì)ToMV的抗性，消除了病毒對(duì)植株長勢的不良影響，已初步顯示出良好的效果[20]。

3.3 ToCV的檢測

ToMV與TMV和ToMMV同是帚狀病毒科煙草花葉病毒屬的典型成員，親緣關(guān)系很近，利用血清學(xué)檢測這3種病毒時(shí)有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)，不能將病毒鑒定區(qū)分開來[4]。在本研究中，在利用小RNA深度測序技術(shù)進(jìn)行病毒的鑒定后再利用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，利用以番茄斑駁病毒基因組序列(KX898034)為模板設(shè)計(jì)的引物均能擴(kuò)增出條帶，但將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序后與ToMV的相似性最高，所以在對(duì)該病毒進(jìn)行檢測時(shí)只是做RT-PCR檢測不能準(zhǔn)確判斷其是否為番茄花葉病毒，要結(jié)合測序結(jié)果進(jìn)行判斷。