李楠楠，包永睿，2，3，4，鄭義博，王鶴辰，孟憲生，2，3，4*（. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連6600；2. 遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 6600；3. 遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連6600；4. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)-安捷倫現(xiàn)代中醫(yī)藥多組學(xué)研究合作實驗室，遼寧 大連 6600）

木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶Orozylum indicum（L.）Vent.的干燥成熟種子，具有清肺利咽，疏肝和胃的功效[1]。黃酮是木蝴蝶的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[2-4]。微流控芯片（microfluidic chip）具有微量化、超高通量化、集成化等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、疾病診斷與治療、藥物篩選等領(lǐng)域[5-7]。本研究應(yīng)用微流控芯片技術(shù)研究木蝴蝶總黃酮類成分在體外對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，不僅為木蝴蝶作為抗肝癌藥物的研究奠定基礎(chǔ)，也為中藥抗腫瘤藥物的體外藥理學(xué)研究提供新的方法。

1 材料

1.1 儀器

TG-2U型光刻機(jī)（北京中科同志科技有限公司）；LSP04-1A精密注射泵（保定蘭格公司）；ECLIPSE-TI 倒置熒光顯微鏡（日本NIKON 公司）；RT-PCR（Piko Thermol公司）；通用電泳儀（美國BD公司）；直拉單晶拋光硅片（哈爾濱特博科技有限公司）。

1.2 試藥

木蝴蝶藥材購自大連同仁堂藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為Orozylum indicum（L.）Vent.的干燥成熟種子；木蝴蝶總黃酮（由本實驗室制備，經(jīng)紫外分光光度計測定純度大于90%）。10%胎牛血清、1%青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公 司）；TRlzol Reagent（美國Life公司）；RIPA裂解液（美國ambion公司）；RT-PCR試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、飛克特超敏ECL發(fā)光液（大連美侖生物科技有限公司）；抗體Anti-p38 MAPK phosphor（Thr180/Tyr182）（美國Arigo公司）；抗體p38 MAPK、β-actin（美國Proteintech公司）。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞HepG2，由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

按常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。隔日換液、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞做后續(xù)實驗。

2.2 藥品的配制

取適量木蝴蝶總黃酮，用DMEM培養(yǎng)液溶解，配制成1.0 mg·mL－1含藥培養(yǎng)液，過 0.22μm 微孔濾膜，4℃保存，備用。

2.3 芯片的設(shè)計及制作

基于實驗室較為成熟的芯片制作工藝，采用軟光刻法[8-9]制作陽模，采用澆注法[10]將彈性材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）澆注于陽模上形成芯片的閥層及通道層，最后采用氧等離子不可逆鍵合的方法[11]將PDMS結(jié)構(gòu)與載玻片鍵合在一起形成PDMS-玻璃復(fù)合型芯片即“遷移芯片”。該芯片由上至下分別為閥控層、通道層和玻璃層，包括3個培養(yǎng)液入口，3個閥控液體入口，2個細(xì)胞入口，8個廢液流出口。

2.4 芯片中細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，用100 μL培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。先通入閥控液體，再通過微量注射器將細(xì)胞從芯片的細(xì)胞注入口注入，37℃培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)12 h后使用精密注射泵以0.2 μL·min－1的流速向芯片中通入培養(yǎng)液，繼續(xù)流動培養(yǎng)24 h。將液閥關(guān)閉，使用精密注射泵以0.2 μL·min－1的流速向芯片中通入藥物，給藥作用48 h，用顯微鏡在遷移區(qū)域拍照，用IPP軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)[12]，按照下面公式計算相對遷移率并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。相對遷移率（%）＝（實驗組遷移細(xì)胞數(shù)/空白組遷移細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.5 孔板劃痕實驗

取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞，PBS清洗，0.25%的胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個·mL－1，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁完全。使用1 mL槍頭在每組孔底部劃出“一”字形劃痕，然后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，使用PBS清洗3次，設(shè)空白對照組（加細(xì)胞，但不加藥物）、木蝴蝶總黃酮組（TF組，藥物干預(yù)48 h），用顯微鏡在遷移區(qū)域拍照。

2.6 PT-PCR法實驗

將處于對數(shù)生長期的人肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，木蝴蝶總黃酮干預(yù)48 h 后消化收集細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA[13]。應(yīng)用RT-①PCR試劑盒明書操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA并合成目的基因。引物序列如下：①β-actin：F 5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，R 5'-TTTGATGTCACGCACGATTT-3'； ②p38：F 5'-CGGCACACTGATGACGAAAT-3'，R 5'-CAACGTTCTTCCGGTCAACA-3'。

2.7 Western blot實驗

取對數(shù)生長期人肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，木蝴蝶總黃酮干預(yù)48 h后消化收集細(xì)胞，加入RIPM、PMSF、磷酸酶抑制劑裂解提取總蛋白。采用NanoDrop 5000 BSA法測定蛋白濃度，PBS緩沖液調(diào)整使各組蛋白終濃度相同。采用SDS-PAGE法，5%濃縮膠和8%分離膠，在100 V電壓下濃縮30 min，調(diào)節(jié)電壓120 V電泳分離蛋白質(zhì)，在160 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h，取出PVDF膜用BSA溶液室溫?fù)u床封閉2 h。封閉結(jié)束后，將PVDF膜在一抗（5%BSA按照1∶500進(jìn)行稀釋）、二抗（5%BSA按照1∶5000進(jìn)行稀釋）中孵育，TBST搖床清洗，ECL法進(jìn)行顯色，采用Image J軟件分析條帶灰度值[14]，計算各組蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗結(jié)果以±s表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05說明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 遷移芯片

根據(jù)實驗需求，本課題組設(shè)計一種用于研究藥物對細(xì)胞遷移影響的芯片——PDMS-玻璃復(fù)合芯片，設(shè)計圖及芯片實物圖見圖1。該芯片包括三層：PDMS閥層，通入液體作為液閥，可控制通道的開合，調(diào)節(jié)細(xì)胞和液體的流向；PDMS通道層，可作為細(xì)胞或液體的通道；玻璃層，用于細(xì)胞貼壁。采用氧等離子不可逆鍵合而成，其中細(xì)胞注入口、藥物注入口、廢液口等位置如圖1所示。

圖1 遷移芯片的結(jié)構(gòu)示意圖（A）和實物圖（B）Fig 1 Schematic diagram（A）and physicalmap（B）of the microfluidic chip

3.2 基于遷移芯片木蝴蝶總黃酮類對人肝癌細(xì)胞HepG2遷移的影響

如圖2所示，關(guān)閉液閥前，即給藥0 h時，HepG2細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)通道呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，胞質(zhì)透明，生長狀態(tài)良好；關(guān)閉液閥后，細(xì)胞培養(yǎng)腔與相鄰?fù)ǖ老嗤ǎ^續(xù)培養(yǎng)24 h后，空白組細(xì)胞向相鄰?fù)ǖ郎L，木蝴蝶總黃酮也有少量細(xì)胞向相鄰?fù)ǖ肋w移生長，但是遷移率較低。木蝴蝶總黃酮組24 h、48 h相對遷移率分別為16.59%、8.06%，與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。說明木蝴蝶總黃酮能很好地抑制腫瘤細(xì)胞遷移。

圖2 HepG2細(xì)胞在芯片中的遷移狀態(tài)（A，100×）和遷移統(tǒng)計結(jié)果（B）Fig 2 Migration of HepG2 cells in the chip（A，100×）and statistical data of the cell migration（B）

3.3 基于劃痕實驗?zāi)竞傸S酮類對人肝癌細(xì)胞HepG2遷移的影響

如圖3所示，給藥0 h時，各組HepG2細(xì)胞在孔板底部呈貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，胞質(zhì)透明，生長狀態(tài)良好。培養(yǎng)24 h后，空白組細(xì)胞向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”變?。荒竞傸S酮組部分發(fā)生皺縮，細(xì)胞變圓，但是并未向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”無變化。培養(yǎng)48 h后，空白組劃痕空白密布肝癌細(xì)胞，“傷口”幾乎愈合；TF組細(xì)胞大部分發(fā)生皺縮、變圓，部分細(xì)胞已死亡、懸浮于培養(yǎng)液中，但是并未向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”無變化。說明木蝴蝶總黃酮具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用。

圖3 劃痕實驗各組HepG2細(xì)胞遷移狀態(tài)圖（100×）Fig 3 Migration of HepG2 in each group of scratch test（100×）

3.4 木蝴蝶總黃酮對相關(guān)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

采用RT-PCR法和Western blot法檢測相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的變化，由圖4可知，木蝴蝶總黃酮能降低p38 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)（P＜0.05），能降低p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)（P＜0.01）。

圖4 木蝴蝶總黃酮對HepG2細(xì)胞中p38 mRNA（A）和p38蛋白質(zhì)（B）相對表達(dá)量的影響（n＝3，±s）Fig 4 Effect of TF on p38 mRNA expression（A）and protein expression（B）of HepG2 cells（n＝3，±s）

4 討論

本研究基于實驗室成熟的芯片制作工藝，設(shè)計并制作了用于研究細(xì)胞遷移的微流控芯片，即遷移芯片。該芯片由閥層、通道層、玻璃層組成，閥層和通道層上下對應(yīng)，是模擬傳統(tǒng)孔板劃痕遷移實驗。當(dāng)上層閥層中通入液體后，由于壓力的作用，PDMS會發(fā)生彈性形變，通入液體的通道將下壓，與下層通道層中對應(yīng)的通道重合，將其與通道層中細(xì)胞流入通道阻斷，即造成“劃痕”，向通道層中細(xì)胞通道通入細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，將液閥關(guān)閉，此時細(xì)胞與相鄰的通道相連接，細(xì)胞則可向空白通道處遷移生長。為防止使用時通道塌陷，本課題組在芯片中間加入長橢圓形的支撐結(jié)構(gòu)，使該芯片可重復(fù)多次使用。該芯片通過閥控裝置來模擬“劃痕”，并且這種劃痕不會對細(xì)胞造成機(jī)械性損傷，更接近癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程。為了驗證該芯片的適用性，本研究同時使用傳統(tǒng)的劃痕法進(jìn)行驗證。劃痕法實驗結(jié)果與微流控芯片結(jié)果均說明木蝴蝶總黃酮具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，具有進(jìn)一步研究的價值。同時也說明微流控芯片法可以替代孔板內(nèi)進(jìn)行的遷移研究實驗，并存在簡單、快捷的優(yōu)勢。

MAPK即絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase）是一系列與腫瘤發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)者，包括細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡、存活和耐藥性等[15-16]。p38是MAPK激酶中的一種，與癌癥具有很大的相關(guān)性[17]。Dalasanur等[18]的研究表明，在乳腺癌中激活的p38可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明木蝴蝶總黃酮能降低p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)，即減少p38的活化，說明木蝴蝶總黃酮能抑制p38活化，抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明木蝴蝶總黃酮具有明顯的體外抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與抑制p-p38蛋白質(zhì)的表達(dá)，減少p38的活化有關(guān)。