石碧茹，高建，趙晶，劉二偉，高秀梅，韓立峰（天津中醫(yī)藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 301617）

墨旱蓮始載于唐代 《新修本草》，為菊科一年生草本植物醴腸Eclipta prostrateL.的干燥地上部分，是中醫(yī)常用補陰中藥。性寒，味甘、酸，入肝、腎經(jīng)，入陰血、善斂固，具有滋補肝腎、烏須固齒、涼血止血等功效[1]。墨旱蓮主要的化學成分有三萜類、內(nèi)酯類、香豆草醚類、黃酮類、噻酚類、甾體類、揮發(fā)油以及有機酸等[2-5]。關于墨旱蓮的含量測定報道大多集中在香豆草醚和黃酮類上，如蟛蜞菊內(nèi)酯、異去甲基蟛蜞菊內(nèi)酯、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、醴腸醛、木犀草素、芹菜素齊墩果酸[6-10]。本課題組對墨旱蓮化學成分的研究發(fā)現(xiàn)其皂苷類成分含量較高，采用超高效液相色譜配合亞2 μm小顆粒粒徑填料色譜柱，對墨旱蓮藥材提取物進行了快速分離，再配合高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜平臺（HPLC-QQQMS），建立了指紋圖譜定性方法[11]，結(jié)果顯示墨旱蓮A為墨旱蓮藥材中含量較高的化學成分。

文獻報道，旱蓮苷A具有抑菌、抗肺纖維化、抑制骨關節(jié)炎等多方面藥理活性[12-14]，最近有文獻報道旱蓮苷A還能抑制非小細胞肺癌[15-16]。研究中藥提取純化的單體活性成分的藥動學行為對新藥開發(fā)具有重要意義。本課題組前期對旱蓮苷A口服藥動學及組織分布進行了系統(tǒng)研究[17]，由于皂苷類成分大多具有口服吸收不好，生物利用度低的特點，本研究進一步利用HPLC-QQQ-MS技術(shù)，測定大鼠尾靜脈注射給藥旱蓮苷A后藥動學參數(shù)，為旱蓮苷A的生物利用及后續(xù)新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

SD 雄性大鼠6 只，體質(zhì)量在（200±20）g [SPF級，天津市山川紅實驗動物科技有限公司]。所有大鼠在統(tǒng)一環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周，每日12 h明暗交替，溫度22℃，期間自由飲食和飲水。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6430三重四極桿質(zhì)譜儀（Agilent公司）；Mill-QⅡ型超純水器（Millipore公司）；3K15高速離心機（Sigma公司）；N-EAVP 111氮吹儀（美國Organomation公司）；AX205十萬分之一天平（Mettler Toledo公司）；XW-80A渦旋混合器（滬西分析儀器廠）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；－80℃超低溫冰箱（美國Thermo Heto公司）。

1.3 試藥

乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司）；色譜純試劑乙酸（美國TEDIA試劑公司）；超純水由Mill-QⅡ 型超純水凈化系統(tǒng)制得；生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司）。旱蓮苷A對照品（實驗室自制得到，經(jīng)過HPLC-ELSD檢測，其純度＞98%[17]）；人參皂苷Rg1（內(nèi)標，純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%乙酸水（B），梯度洗脫（0～1 min，10%～60%A；1～5 min，60%～90%A；5～9 min，90%A；9～10 min，90%～10%A，10～16 min，10%A）；流速0.4 mL·min－1，柱溫25℃；進樣量5 μL。

離子源為電噴霧離子源（ESI源），采用多反應監(jiān)測（MRM）模式，負離子監(jiān)測；毛細管電壓為4.0 kV，以N2作為干燥氣，干燥氣溫度為350℃，流速設定10 mL·min－1。旱蓮苷A和人參皂苷Rg1優(yōu)化后的離子對，碰撞能量，碎裂電壓見表1。

表1 優(yōu)化后質(zhì)譜參數(shù)及用于定量分析的離子通道Tab 1 Optimized mass parameters and MRM transitions

2.2 對照品儲備液和內(nèi)標溶液配制

精密稱取旱蓮苷A 10.00 mg和人參皂苷Rg11.00 mg，分別置于10 mL量瓶中，用體積分數(shù)為50%的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別配制為1 mg·mL－1和100 μg·mL－1的對照品儲備液，然后將旱蓮苷A對照品儲備液稀釋得到一系列不同質(zhì)量濃度的工作液（20.0、50.0、100.0、500.0、1000.0、2000.0 ng·mL－1）。人參皂苷Rg1用50%的甲醇稀釋得到質(zhì)量濃度為250 ng·mL－1內(nèi)標溶液。對照品溶液儲存在4℃冰箱備用。

2.3 血漿樣品處理

取冷凍的大鼠血漿樣品，于室溫融化后渦旋、混勻。精密吸取血漿樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，依次精密加入10 μL內(nèi)標溶液（250 ng·mL－1人參皂苷Rg1）、10 μL空白甲醇溶液，渦旋1 min混勻，再加入380 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩10 min 后靜置，14 000 r·min－1離心10 min，取上清液進樣測定。

2.4 方法學考察[18-19]

2.4.1 專屬性試驗 取空白血漿100 μL，不加內(nèi)標，其他按照“2.3”項下方法處理，進樣分析；將對照品溶液（500 ng·mL－1）及內(nèi)標溶液（250 ng·mL－1）加入空白血漿中，同法處理；取大鼠尾靜脈給藥后的血漿樣品，同法處理；結(jié)果顯示目標化合物及內(nèi)標峰形良好，血樣中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾（見圖1）。

圖1 空白血漿（A）、空白血漿加對照品（B）、大鼠給藥后的血漿樣品（C）總離子流（TIC）圖Fig 1 TIC chromatogram of blank plasma（A），blank plasma spiked with ecliptasaponin A and the IS（B），and plasma sample after administration（C）

2.4.2 線性關系的考察 取空白血漿100 μL，加入內(nèi)標溶液10 μL和系列濃度對照品溶液各10 μL，除不加10 μL空白甲醇溶液外，其他按照“2.3”項下方法操作，最終標準曲線各點質(zhì)量溶液濃度為2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL－1，取上清液5 μL進樣測定。以血漿樣品中待測物與內(nèi)標的峰面積比值（Y）為縱坐標，以待測物質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，用加權(quán)最小二乘法進行回歸計算，權(quán)重系數(shù)為1/χ，得回歸方程為Y＝0.2113X＋0.0060，r為0.9985。

2.4.3 精密度與準確度考察 取大鼠空白血漿100 μL，加入旱蓮苷A對照品配制成質(zhì)量濃度為5.0、50.0、200.0 ng·mL－1的血漿樣品各6 份，按“2.3”項下方法操作，連續(xù)測定3 d，計算待測化合物峰面積和內(nèi)標峰面積比值，代入隨行標準曲線中計算濃度。測定3批血漿樣品，分別計算日內(nèi)、日間精密度和準確度，結(jié)果旱蓮苷A日內(nèi)及日間精密度RSD值均小于5.6%，準確度在86.63%～106.59%，表明該方法的精密度與準確度良好。

2.4.4 提取回收率與基質(zhì)效應 取空白血漿100 μL，分別加入質(zhì)量濃度為200、2000、8000 ng·mL－1的墨旱蓮苷A對照品溶液各10 μL，按“2.3”項下方法操作，進樣測定；配制旱蓮苷A的質(zhì)量濃度為5.0、50.0、200.0 ng·mL－1的血漿樣品各3 份，進樣測定；另取空白血漿，按“2.3”項下方法操作，得含空白基質(zhì)的殘渣，分別加入100 μL 80%甲醇配制低、中、高的旱蓮苷A對照品溶液復溶，進樣測定，記錄兩次旱蓮苷A的峰面積，計算提取回收率；同樣條件下，進樣相應低、中、高濃度對照品溶液；將對照品溶液與純對照品得出的峰面積相比，計算得到基質(zhì)效應。旱蓮苷A各濃度提取回收率在71.30%～81.30%（RSD＜7.3%），基質(zhì)效應在70.29%～88.61%（RSD＜12.0%），均符合生物樣品檢測的要求。

2.4.5 血漿質(zhì)控樣品穩(wěn)定性考察 取空白血漿100 μL，配制成旱蓮苷A質(zhì)量濃度為5.0、50.0、200.0 ng·mL－1的對照品血漿樣品，將血漿樣品室溫放置24 h，反復凍融3 次和－80℃凍融7 d后處理并測定，將樣品實測值與初始值比較，結(jié)果準確度在91.37%～119.82%，RSD在4.5%～13.3%，表明樣品在儲存和處理過程中相對穩(wěn)定。

2.5 藥動學實驗

SD雄性大鼠6 只，體質(zhì)量在（200±20）g，給藥前禁食12 h，自由飲水，尾靜脈注射旱蓮苷A生理鹽水混懸液（1 mg·kg－1），分別于給藥前及給藥后0、0.08、0.17、0.33、0.67、1、1.5、2、4、6、12、24 h經(jīng)大鼠眼底靜脈叢取血約0.3 mL，置于1.5 mL肝素化離心管中，6000 r·min－1離心10 min，分離血漿，置于－80℃冰箱中儲存，直至進樣分析。根據(jù)不同時間點血藥濃度具體結(jié)果，采用DAS 1.0軟件計算大鼠尾靜脈注射給藥后旱蓮苷A后的藥動學參數(shù)見表2；平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

表2 大鼠尾靜脈注射旱蓮苷A后主要藥動學參數(shù)(n＝6)Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of ecliptasaponin A in rat after intravenous injection (n＝6)

圖2 大鼠尾靜脈注射旱蓮苷A后的平均血藥濃度-時間曲線圖（n＝6）Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of ecliptasaponin A in rats after intravenous administration（n＝6）

由結(jié)果可知，大鼠尾靜脈給藥旱蓮苷A后符合二室開放藥動學模型，旱蓮苷A的血藥濃度在第一個取血時間點達峰，并在體內(nèi)迅速分布，血藥濃度在1 h之內(nèi)迅速下降，說明化合物在體內(nèi)的消除速度很快，半衰期較短。

3 討論

生物樣品基質(zhì)組成復雜，而一般目標化合物含量比較低，樣品在測定前需要選用恰當?shù)那疤幚矸椒?，使目標化合物純化和富集，一方面可以除去介質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂肪和尿素等較大分子物質(zhì)的干擾，另一方面也可以將與蛋白質(zhì)或其他內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合的藥物解離下來進行測定。本實驗對蛋白沉淀法和液液萃取法進行了考察，結(jié)果蛋白沉淀法比液液萃取法更方便、簡單、快速，故采用蛋白沉淀法對旱蓮苷A在大鼠血漿進行前處理。蛋白沉淀法分別采用1∶3、1∶4的甲醇、乙腈，結(jié)果顯示，1∶4的甲醇沉淀蛋白回收率較好。

采用LC-MS進行血樣定量分析時，為了減少樣品處理中的操作誤差、藥物濃度低、內(nèi)源性雜質(zhì)干擾、質(zhì)譜檢測時因離子化效率不同產(chǎn)生的差異等問題，在實驗中常加入內(nèi)標來校正。實驗中選擇了與旱蓮苷A結(jié)構(gòu)相似、色譜行為相近、檢測組分中沒有的且與所含成分不發(fā)生相互作用的人參皂苷Rg1作為內(nèi)標。梯度洗脫方式，分離度較好，質(zhì)譜響應穩(wěn)定，無內(nèi)源性干擾[19]。

結(jié)合課題組前期報道過大鼠口服旱蓮苷A后的相關藥動學參數(shù)[17]及本實驗尾靜脈注射后得到的藥動學參數(shù)，根據(jù)公式，絕對生物利用度F＝（AUC PO/劑量PO）/（AUC IV/劑量IV），可計算出旱蓮苷A的生物利用度約為1.68%。表明旱蓮苷A的生物利用度較低，后續(xù)新藥開發(fā)時應予以重點關注。