武夢(mèng)琳，秦崇臻，柴玉娜，盧瑤瑤，汪新茹，張晶敏，齊光照（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州450052）

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）是最重要的藥物代謝酶，在外源性藥物的解毒和內(nèi)源性分子的生物合成中發(fā)揮著重要作用[1-2]。CYP3A4在藥物代謝酶中占舉足輕重的地位，超過60%的臨床藥物通過此酶代謝，并且其與許多藥物間的相互作用有關(guān)，因此藥物對(duì)于CYP3A4的抑制作用會(huì)導(dǎo)致藥物合用時(shí)出現(xiàn)毒副作用[3-4]。

已有許多關(guān)于中藥對(duì)CYPs抑制作用的研究，如三白草酮對(duì)CYP2C19的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[5]，芹菜素對(duì)CYP2C9的抑制作用[6]，丹參提取物對(duì)CYP450的抑制作用[7-8]等。

廣藿香是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，主要用于防治瘟疫、流行性感冒、腹痛等疾病，以廣藿香為主要成分的中成藥制劑也日益增多[9]。作為廣藿香揮發(fā)油的主要成分之一，廣藿香醇（patchouli alcohol，PA），又稱百秋李醇，是天然植物中提取的三環(huán)倍半萜化合物[10]，具有抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗真菌以及胃腸調(diào)節(jié)等活性[11-13]。目前在臨床上，廣藿香醇也是多種中成藥的重要組分，如藿香正氣顆粒、小兒感冒顆粒以及小兒廣樸止瀉口服液等。其中廣藿香醇作為小兒感冒顆粒的有效成分之一，可以發(fā)汗解表，用于治療小兒外感風(fēng)熱[14]；作為小兒廣樸止瀉口服液的主要成分之一，可以化濕健胃，對(duì)腹痛、腹瀉以及腹脹的治療有著較好的臨床效果[15]。在國(guó)家食品安全中，廣藿香醇因氣味宜人，也常作為食品添加劑和香精香料[16]。因此，應(yīng)當(dāng)特別注意廣藿香醇與其他藥物聯(lián)用時(shí)可能引起的藥物相互作用。

目前關(guān)于廣藿香醇的研究側(cè)重于含量測(cè)定、化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定以及基礎(chǔ)藥理學(xué)方面[10，17-18]，而在藥物相互作用機(jī)制中的影響，以及藥物聯(lián)用時(shí)對(duì)CYPs是否有影響尚未有相關(guān)報(bào)道。為評(píng)估廣藿香醇的用藥安全，本文通過Cocktail法以探針底物為檢測(cè)體系，探討廣藿香醇在人肝微粒體和重組酶中的作用以及酶促動(dòng)力學(xué)的影響，旨在為臨床提供安全合理的聯(lián)合用藥依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

美國(guó)Waters公司MS/MS系統(tǒng)：API型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，帶電噴霧離子化源（ESI）及數(shù)據(jù)采集Masslynx軟件；Waters 2695型超高效液相色譜儀帶自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；Luna C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）色譜柱。

1.2 試藥

香豆素（批號(hào)：01260595）、7-羥基香豆素（批號(hào)：54826）、甲苯磺丁脲（批號(hào)：T0891）、4-羥基甲苯磺丁脲（批號(hào)：UC160）、（S）-美芬妥英（批號(hào)：UC175）、4'-羥基美芬妥英（批號(hào)：H146）、美托洛爾（批號(hào)：80337）、α-羥基美托洛爾（批號(hào)：80073）、咪達(dá)唑侖（批號(hào)：M-908）、1-羥基咪達(dá)唑侖（批號(hào)：H-922）、曲馬多（批號(hào)：1672600）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）、輔酶Ⅱ（β-NADP）（Sigma公司）。廣藿香醇（天津萬(wàn)象恒遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)：WXHY-001994，HPLC測(cè)純度＞98%）。甲醇、甲酸、乙腈、叔丁基甲基醚和甲酸銨（廣州迪馬公司，色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。人肝微粒體和人重組酶（BD基因公司）。

2 方法

2.1 微粒體孵育條件

100 mmol·L－1K2HPO4-KH2PO4（pH＝7.4）的緩沖溶液反應(yīng)體系（總體積為200 μL）中加入肝微粒體（終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1）或重組酶（終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1）、3.3 mmol·L－1的MgCl2、1.3 mmol·L－1的β-NADP、3.3 mmol·L－1的G-6-P和對(duì)應(yīng)的藥物，37℃搖動(dòng)水浴中預(yù)孵化5 min，加入0.4 U·mL－1的G-6-PDH（20 μL），37℃水浴20 min之后用含1.13 μmol·L－1曲馬多（內(nèi)標(biāo)）的100 μL甲醇終止反應(yīng)。加入1 mL叔丁基甲基醚，震蕩5 min，3500×g離心10 min。分離出800 μL有機(jī)層用氮?dú)獯蹈桑?00 μL流動(dòng)相溶解之后進(jìn)樣10 μL到質(zhì)譜系統(tǒng)。

2.2 色譜、質(zhì)譜條件

采用課題組以前建立并驗(yàn)證的方法[19]。流動(dòng)相為10 mmol·L－1乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈（13∶87，V/V），流速為0.25 mL·min－1，總時(shí)間為5 min。離子源溫度和去溶劑溫度分別為100℃和400℃。錐孔氣和脫溶劑氣分別設(shè)定為50 L·h－1和400 L·h－1。ESI源，MRM掃 描，正離子模式監(jiān)測(cè)。

2.3 廣藿香醇對(duì)肝微粒體酶抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 廣藿香醇對(duì)CYP450的抑制作用 加入濃度分別為0、0.1、1和10 μmol·L－1廣藿香醇，孵育體系下測(cè)定每個(gè)CYP450對(duì)應(yīng)的特異性底物的代謝物濃度。每個(gè)樣品平行做3份。

加入濃度分別為0.01、0.1、1、10和100 μmol·L－1廣藿香醇，孵育體系下測(cè)定CYP3A4酶活性，將所得數(shù)據(jù)以抑制劑濃度的log值（μmol·L－1）作為橫坐標(biāo)，剩余活性率（%）作為縱坐標(biāo)作圖。采用Graphpad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）軟件計(jì)算廣藿香醇的IC50。

2.3.2 廣藿香醇在人肝微粒體中對(duì)CYP3A4的抑制模型 為了驗(yàn)證廣藿香醇的抑制類型，將廣藿香醇（0、5、10 μmol·L－1）在加入NADPH的人肝微粒體中預(yù)孵育0、10或30 min，然后加入CYP3A4特異性底物咪達(dá)唑侖（5、10或20 μmol·L－1），37℃孵育30 min。每個(gè)樣品平行做3份。所得數(shù)據(jù)采用SigmaPlot軟件（版本10.0，Systat software，Inc.：Chicago，IL，USA） 做Lineweaver-Burk圖和二次作圖。

2.3.3 CYP3A4重組酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證廣藿香醇選擇性抑制CYP3A4，將廣藿香醇（0.01、0.1、1、10和100 μmol·L－1）、咪達(dá)唑侖和NADPH系統(tǒng)在10 pmol人重組CYP3A4酶中37℃孵育30 min。每個(gè)樣品平行做3份。所得數(shù)據(jù)以抑制劑濃度的log值（μmol·L－1）作為橫坐標(biāo)，剩余活性率（%）作為縱坐標(biāo)作圖，采用Graphpad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）軟件計(jì)算廣藿香醇的IC50。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算人肝微粒體中不同濃度廣藿香醇對(duì)酶活性的影響，每個(gè)樣品平行3份，數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，采用方差分析，P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）通過非線性回歸計(jì)算50%抑制濃度（IC50）值。Lineweaver-Burk圖采用SigmaPlot軟件（版本10.0，Systat software，Inc.：Chicago，IL，USA）制作。

3 結(jié)果

3.1 廣藿香醇對(duì)人肝微粒體中CYP450酶的抑制作用

加入不同濃度廣藿香醇（0、0.1、1和10 μmol·L－1）后對(duì)酶底物代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，分析剩余活性，結(jié)果見圖1A。由圖可知廣藿香醇對(duì)人肝微粒體CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6并無明顯的抑制作用，且與濃度無關(guān)。而在圖1B中，隨著廣藿香醇濃度升高，肝微粒體CYP3A4 活性明顯下降，其IC50值為5.195 μmol·L－1。提示當(dāng)藥物經(jīng)由CYP3A4代謝時(shí)，廣藿香醇可能對(duì)其會(huì)有抑制作用。

圖1 人肝微粒體中不同濃度廣藿香醇對(duì)CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6酶（A）和CYP3A4酶（B）活性的影響Fig 1 Effect of different concentrations of PA on the enzyme activities of CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19 and CYP2D6（A），and CYP3A4（B）in human liver microsomes

3.2 廣藿香醇對(duì)CYP3A4的抑制特點(diǎn)

從圖2可以看出，不同濃度的廣藿香醇對(duì)CYP3A4抑制作用不同，隨著廣藿香醇濃度的增加，CYP3A4活性降低；而不同時(shí)間段的廣藿香醇對(duì)CYP3A4抑制作用沒有明顯的差異。因此廣藿香醇呈現(xiàn)濃度依賴性地抑制肝微粒體中CYP3A4催化的咪達(dá)唑侖羥基化，但不具有時(shí)間依賴性。

圖2 廣藿香醇對(duì)CYP3A4酶的抑制特點(diǎn)Fig 2 Inhibition characteristics of PA on CYP3A4 enzyme

3.3 廣藿香醇對(duì)CYP3A4的抑制作用類型分析

以底物濃度1/[S]作為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度1/[V]作為縱坐標(biāo)，按 Lineweaver-Burk 法作圖，確定提取物的抑制類型，結(jié)果見圖3A。以廣藿香醇濃度作為橫坐標(biāo)，Lineweaver-Burk圖中幾條直線的斜率作為縱坐標(biāo)，作圖得圖3B，據(jù)此可以得到廣藿香醇抑制常數(shù)（Ki）。

從圖3A中可以看出，不同濃度廣藿香醇共同孵育之后所得的曲線有一個(gè)共同交點(diǎn)并且落在橫坐標(biāo)軸上，說明廣藿香醇對(duì)于CYP3A4抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。從圖3B中可以計(jì)算得到廣藿香醇抑制常數(shù)Ki為0.86 μmol·L－1。

圖3 廣藿香醇對(duì)CYP3A4酶代謝的動(dòng)力學(xué)直線回歸方程Fig 3 Kinetic linear regression equation of PA for CYP3A4 enzyme metabolism

3.4 廣藿香醇對(duì)CYP3A4重組酶的抑制作用

采用10 pmol人重組CYP3A4與廣藿香醇共同孵育，驗(yàn)證廣藿香醇對(duì)于CYP3A4選擇性抑制作用，結(jié)果見圖4，發(fā)現(xiàn)廣藿香醇可以顯著抑制CYP3A4活性，其IC50值為5.625 μmol·L－1，廣藿香醇對(duì)CYP3A4具有選擇性抑制作用，這與在人肝微粒體中實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 人重組CYP3A4酶中廣藿香醇（0.01、0.1、1、10及100 μmol·L－1）對(duì)咪達(dá)唑侖代謝的影響Fig 4 Effect of PA（0.01，0.1，1，10 and 100 μmol·L－1） on midazolam metabolism in recombinant human CYP3A4 enzyme

4 討論

聯(lián)合用藥在患者治療過程中非常普遍，但是聯(lián)合用藥過程中存在藥物相互作用的可能性。藥物相互作用一般由CYPs酶代謝引起，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)[20-21]。目前，有關(guān)藥物相互作用的報(bào)道越來越多，因此研究藥物對(duì)CYPs的抑制作用可以預(yù)測(cè)可能發(fā)生的藥物相互作用，從而避免或減少聯(lián)合用藥時(shí)的嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。廣藿香醇具有抗炎、抗氧化、抑菌、抑制病毒、抗克氏錐蟲、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理活性[9-13，17]。其在臨床使用的過程中，可能會(huì)與經(jīng) CYP3A4代謝消除的藥物聯(lián)合使用，從而影響藥物的有效性和安全性。常見含廣藿香醇的藥物如藿香正氣水，應(yīng)當(dāng)特別注意與其他藥物聯(lián)用時(shí)可能引起的藥物相互作用。本研究利用經(jīng)典的肝微粒體體外孵育模型，探討廣藿香醇對(duì)CYP3A4的影響及作用機(jī)制。

本研究首次檢測(cè)了廣藿香醇對(duì)CYPs 的抑制作用、抑制類型以及機(jī)制模型，發(fā)現(xiàn)廣藿香醇對(duì)CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6活性沒有明顯的抑制作用，對(duì)CYP3A4活性的抑制作用呈濃度依賴性，但不具有時(shí)間依賴性。在廣藿香醇對(duì)CYP3A4的抑制作用類型分析中，得到了Ki值為0.86 μmol·L－1，可以判斷藥物抑制作用的類型主要是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。隨后采用體外人肝微粒體孵育和重組酶驗(yàn)證作為主要的實(shí)驗(yàn)方法，通過CYP3A4重組酶驗(yàn)證了這一結(jié)果。因此，當(dāng)聯(lián)用藥物經(jīng)由CYP3A4代謝時(shí)，可能會(huì)由于廣藿香醇的抑制作用，該藥不能被及時(shí)代謝，而導(dǎo)致藥物的血藥濃度升高，造成蓄積中毒等情況。這為預(yù)測(cè)藥物和藥物之間的相互作用以及臨床上應(yīng)用含廣藿香醇成分的藥物的安全性提供了參考，但其在臨床使用中的真實(shí)情況，尚需動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。