禽白血病病毒和雞傳染性貧血病毒二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

張民秀 謝芝勛 謝志勤 謝麗基 張艷芳 鄧顯文 曾婷婷 范晴 羅思思 黃嬌玲

摘要：【目的】建立同時(shí)鑒別ALV和CIAV的二重?zé)晒猸h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法，為臨床上快速診斷及有效防控ALV和CIAV的單一或混合感染提供技術(shù)支持?！痉椒ā繀⒖糀LV（A亞群、B亞群、C亞群、D亞群和J亞群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列，設(shè)計(jì)2套用于LAMP的特異性引物，并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆蓋區(qū)域分別設(shè)計(jì)雙標(biāo)記探針[ALV-Probe（5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)）和CIAV-Probe（5'端標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)）]。在Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于多色熒光系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行觀察分析;并通過(guò)特異性試驗(yàn)、靈敏度試驗(yàn)及臨床樣品檢測(cè)驗(yàn)證二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法的適用性和可靠性?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化后的二重?zé)晒釲AMP反應(yīng)體系20.0 μL：DNA/cDNA模板2.0 μL，2×Reaction Mix 10.0 μL，Bst DNA聚合酶0.8 μL，內(nèi)引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作濃度40.0 μmol/L）各0.8 μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作濃度5.0 μmol/L）各0.4 μL，ALV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.4 μL，CIAV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，以ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：62 ℃反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。建立的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法能特異性同時(shí)檢測(cè)ALV和CIAV，對(duì)其他禽類病原體無(wú)特異性擴(kuò)增;檢測(cè)CIAV和ALV單一模板的下限均為102拷貝/?L，檢測(cè)混合模板時(shí)ALV的檢測(cè)下限為102拷貝/?L、CIAV的檢測(cè)下限為103拷貝/?L。應(yīng)用建立的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法對(duì)13份咽喉和泄殖腔棉拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果的吻合率達(dá)100%?！窘Y(jié)論】建立的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)鑒別診斷ALV和CIAV，具有特異性好、敏感性高及污染風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)多色熒光系統(tǒng)進(jìn)行肉眼觀察，適用于ALV和CIAV的臨床快速篩查。

關(guān)鍵詞： 禽白血病病毒（ALV）;雞傳染性貧血病毒（CIAV）;二重?zé)晒釲AMP;探針;特異性;敏感性

中圖分類號(hào)： S854.44? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）07-2007-08

A duplex fluorescence LAMP assay for identification of avian leukosis virus and chicken infectious anemia virus

ZHANG Min-xiu， XIE Zhi-xun*， XIE Zhi-qin， XIE Li-ji， ZHANG Yan-fang，

DENG Xian-wen， ZENG Ting-ting， FAN Qing， LUO Si-si， HUANG Jiao-ling

（Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，

Nanning? 530001， China）

Abstract：【Objective】To establish a duplex fluorescence loop-mediated isothermal amplification（LAMP） method for simultaneous identification of avian leukosis virus（ALV） and chicken infectious anemia virus（CIAV）， and provide technical support for clinical rapid diagnosis and effective prevention and control of single or mixed infections of ALV and CIAV. 【Method】According to the conserved sequences of the ALV（A， B， C， D and J subgroups） pol gene and the CIAV VP2 gene， two sets of specific primers were designed for LAMP，and a double labeled probe was designed in the areas covered by F1c and B1c of ALV and CIAV sequences， respectively[ALV-probe （5' end was labeled with a FAM fluorescent dye， 3' end was labeled with a BHQ3 quencher dye） and CIAV- probe （5' end was labeled with a CY5 fluorescent dye， 3' end was labeled with BHQ3 quencher dye）]. After the reaction in the Loopamp LA-320C turbidimeter， the results could be observed in the polychromatic fluorescence system. The applicability and reliability of the duplex fluorescence LAMP test method were validated by specificity testing， sensitivity testing， and clinical sample testing. 【Result】The duplex fluorescence LAMP was optimized in 20 μL volume containing DNA /cDNA template 2.0 μL， 2×Reaction Mix 10.0 μL， Bst DNA polymerase 0.8 μL， internal primers ALV-FIP， ALV-BIP， CIAV-FIP and CIAV-BIP （working concentration 40.0 μmol/L） 0.8 μL each. External primers were ALV-F3， ALV-B3， CIAV-F3 and CIAV-B3（working concentration 5.0 μmol/L） 0.4 μL each. ALV-Probe（working concentration 0.5 μmol/L） 0.4 μL ， CIAV-Probe（working concentration 0.5） μmol/L） 0.8 μL ， making up to 20.0 μL volume with ddH2O. Amplification procedure： the reaction mixture was incubated at 62 ℃ for 60 min and inactivation at 80 ℃ for 5 min. The results showed that duplex LAMP detection method could simultaneously detect ALV and CIAV， and had no specific amplification for other avian pathogens; the minimum detection limit of single template of CIAV and ALV in sensitivity test were 102 copies/?L. The minimum detection limit of mixed template in sensitivity test was 102 copies/?L for ALV and 103 copies/?L for CIAV; 13 throat and cloacal swabs were detected by the duplex fluorescence LAMP. The results were consistent with those of ALV and CIAV by single PCR me-thods， and the coincidence rate was 100%. 【Conclusion】The duplex fluorescence LAMP method for simultaneous detection of ALV and CIAV in this study has the advantages of good specificity， high sensitivity and low pollution. The detection results can be observed by naked eyes in the polychromatic fluorescence system， which is applicable for rapid clinical screening of ALV and CIAV.

Key words： avian leukosis virus（ALV）; chicken infectious anemiavirus（CIAV）; duplex fluorescence LAMP; probe; specificity; sensitivity

Foundation item：Guangxi Science Base and Talents Special Project（Guike AD17195083）; Guangxi Science and Technology Key Project（Guike AA17204057）; Guangxi Bagui Scholars Project（2019-79）; National 10000 Talents Plan for Leading Talents in Scientific and Technological Innovation（W02060083）

0 引言

【研究意義】目前，養(yǎng)殖雞群中免疫抑制性病毒二重及多重感染的現(xiàn)象普遍存在。禽白血?。ˋvian leukosis，AL）和雞傳染性貧血（Chicken infectious anemia，CIA）是常見的雞免疫抑制病，引起這2種疾病的病原體分別是禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）和雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CIAV），二者共同感染時(shí)能顯著降低疫苗的免疫效果，造成雞群無(wú)法有效抵抗其他病毒感染而繼發(fā)相關(guān)疾病，繼而影響雞群健康及其養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益（于帥，2015;李鑫，2016）。我國(guó)的養(yǎng)殖雞群普遍存在CIAV感染，且常與ALV、馬立克氏病病毒（MDV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（REV）等共同感染，其中CIAV與ALV共同感染的陽(yáng)性率高達(dá)10.8%（王仙等，2017）。此外，禽類弱毒疫苗中存在CIAV和ALV污染，給養(yǎng)禽業(yè)的安全健康生產(chǎn)帶來(lái)巨大威脅（胡曉苗等，2014;房立春等，2016）。因此，建立一種快速鑒別檢測(cè)CIAV和ALV的方法，對(duì)凈化及控制CIAV和ALV感染具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是將LAMP反應(yīng)試劑混合后，在等溫（60～65 ℃）條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，其結(jié)果通過(guò)肉眼觀察產(chǎn)物的渾濁度、濁度儀檢測(cè)反應(yīng)混合物的沉淀濁度或目測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否發(fā)出熒光即可判斷，具有快速、簡(jiǎn)便和敏感等優(yōu)點(diǎn)（林文慧等，2015;侯謙等，2020）。在我國(guó)已有許多學(xué)者運(yùn)用該技術(shù)建立針對(duì)禽類單一病原體的LAMP檢測(cè)方法（康忠惠，2011;Peng et al.，2011;Xie et al.，2014;Luo et al.，2015;黃海超等，2018），包括針對(duì)ALV和CIAV的單重LAMP檢測(cè)方法（鄧顯文等，2011;康忠惠，2011;劉業(yè)兵等，2011;黃海超等，2018）;同時(shí)開發(fā)出針對(duì)多種病原體的二重及多重LAMP檢測(cè)方法（姜侃等，2015;Nyan and Swinson，2015;范晴等，2017;李森等，2018）。Mahony等（2013）通過(guò)設(shè)計(jì)3套鑒別H1亞型、H3亞型和B型人流感病毒的LAMP引物，反應(yīng)混合物放入熒光PCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)熒光定量PCR熔解曲線的熔解溫度差異可鑒定區(qū)分不同病原體。姜侃等（2015）基于LAMP-熔解曲線診斷成功建立了鑒別食源性沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的二重LAMP檢測(cè)方法。Nyan和Swinson（2015）成功建立了鑒別人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、戊型肝炎病毒（HEV）、登革熱病毒（DENV）和西尼羅河病毒（WNV）的多重LAMP診斷方法，通過(guò)在每個(gè)靶序列的B2和B1c間設(shè)計(jì)1條與靶序列互補(bǔ)的雙標(biāo)記探針，擴(kuò)增產(chǎn)物在紫外燈下發(fā)光，因此通過(guò)電泳可觀察不同病毒形成的梯形條帶差異進(jìn)行判斷。范晴等（2018）通過(guò)設(shè)計(jì)鑒別口蹄疫病毒（FMDV）和水泡性口炎病毒（VSV）的LAMP引物套，并分別在FMDV和VSV的內(nèi)引物（FIP）5'端引入不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并置于多色熒光成像系統(tǒng)下分析，根據(jù)不同目標(biāo)病原體產(chǎn)物發(fā)出的熒光顏色進(jìn)行判定。Suzuki等（2018）在不同病毒的環(huán)引物5'端引入不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)，并于反應(yīng)前在管蓋內(nèi)側(cè)加入陽(yáng)離子多聚物聚乙烯亞胺，反應(yīng)結(jié)束后顛倒反應(yīng)管使管底的特異性產(chǎn)物與陽(yáng)離子多聚物聚乙烯亞胺聚合，短暫離心后，管底產(chǎn)生不同顏色沉淀，根據(jù)在紫外光產(chǎn)生的沉淀顏色即可鑒定區(qū)分病原體。方慶等（2020）嘗試在F1c和B1c覆蓋的區(qū)域設(shè)計(jì)1條雙標(biāo)記探針，成功建立了雞細(xì)小病毒（ChPV）熒光LAMP檢測(cè)方法，只需將反應(yīng)后的反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)下觀察，若反應(yīng)管出現(xiàn)相應(yīng)的熒光則判定為陽(yáng)性，能減少開蓋帶來(lái)的污染風(fēng)險(xiǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于LAMP檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便和敏感等優(yōu)點(diǎn)，已開發(fā)出針對(duì)ALV和CIAV的單重LAMP檢測(cè)方法（鄧顯文等，2011;黃海超等，2018），但至今未見針對(duì)ALV和CIAV二重LAMP檢測(cè)方法的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在LAMP檢測(cè)方法中引入雙標(biāo)記探針引物，建立能同時(shí)鑒別ALV和CIAV的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法，為臨床上快速診斷及有效防控ALV和CIAV的單一或混合感染提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H5（Duck/HK/313/78）和H7亞型（Duck/HK/47/76）cDNA由香港大學(xué)惠贈(zèng)，雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）AV6株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，禽脊髓腦炎病毒（Avian encephalomyelitis virus，AEV）AE1163株由美國(guó)康乃狄格大學(xué)惠贈(zèng)，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）GX6/02株、H9亞型AIV（Duck/Guangxi/1/00）、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）S1133株、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）2012001-1株、禽傳染性支氣管病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）GXIB/02株、雞馬立克病病毒（Mareks disease virus，MDV）2012006-1株、禽4型腺病毒（Fowl adenovirus group 4，F(xiàn)AdV-4）GX2018001株、ALV A亞群GX11 0521株、B亞群GX111230株和J亞群2012004-C5株及CIAV GXC060821株由廣西獸醫(yī)研究所保存提供。13份臨床樣品來(lái)源于廣西某規(guī)?；u場(chǎng)采集的咽喉和泄殖腔拭子，經(jīng)普通PCR鑒定，陽(yáng)性樣品送至華大基因生物科技（深圳）有限公司測(cè)序。按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明提取不同病毒和臨床樣品的RNA或DNA，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA/DNA模板-20 ℃保存?zhèn)溆谩AMP DNA擴(kuò)增試劑盒和Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀購(gòu)自榮研生物科技（中國(guó)）有限公司，EasyPure Viral DNA/RNA Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T克隆載體購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，NanoDrop2000核酸測(cè)定儀購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，多色熒光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1. 2 引物和探針設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中ALV（A、B、C、D和J亞群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列，利用MEGA 4.0和Primer Explorer V4設(shè)計(jì)LAMP引物，其中，外引物包括ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3，內(nèi)引物包括ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP，內(nèi)引物FIP=F1c+F2，BIP=B1c+B2。利用Primer Premier 5.0在ALV和CIAV的F1c和B1c覆蓋區(qū)域分別間設(shè)計(jì)1條探針，即ALV-Probe（5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)）和CIAV-Probe（5'端標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ3淬滅基團(tuán)）。引物和探針序列如表1所示，引物委托華大基因生物科技（深圳）有限公司合成，探針委托寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司合成。同時(shí)基于ALV的env基因和CIAV的VP2基因，合成特異性引物：ALV-F（5'-GGATGAGGTGACTA AGAAAG-3'）和ALV-R（5'-CGAACCAAAGGTAAC ACACG-3'），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度545 bp;以及CIAV-F（5'-CTAAGATCTGCAACTGCGGA-3'）和CIAV-R（5'-CCTTGGAAGCGGATAGTCAT-3'），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度441 bp。特異性引物委托華大基因生物科技（深圳）有限公司合成。

1. 3 陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

使用外引物ALV-F3/ALV-B3和CIAV-F3/CIAV-B3對(duì)陽(yáng)性ALV cDNA和CIAV DNA模板進(jìn)行截短目的基因擴(kuò)增，目的片段長(zhǎng)度分別為217和201 bp，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒。利用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量ALV和CIAV的陽(yáng)性重組質(zhì)粒濃度，再根據(jù)分子量及濃度計(jì)算拷貝數(shù)。

1. 4 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

DNA/cDNA模板2.0 μL，2×Reaction Mix 10.0 μL，Bst DNA聚合酶0.8 μL，內(nèi)引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作濃度40 μmol/L）各0.8 μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作濃度5.0 μmol/L）各0.8 μL，ALV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，CIAV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，以無(wú)RNAase水為模板加入反應(yīng)管中。將反應(yīng)管置于Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中調(diào)整反應(yīng)溫度（60、61、62、63和64 ℃）反應(yīng)60 min，以確定最佳反應(yīng)溫度，80 ℃滅活5 min，試驗(yàn)結(jié)束后將反應(yīng)管直接置于多色熒光成像系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行判定。

確定最佳反應(yīng)溫度后，按ALV-FIP/ALV-BIP∶CIAV-FIP/CIAV-BIP∶ALV-F3/ALV-B3∶CIAV-F3/CIAV-B3∶ALV-Probe∶CIAV-Probe不同比例進(jìn)行引物濃度優(yōu)化，不同比例的引物終濃度（μmol/L）分別為1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.02∶0.02、1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.01∶0.02和1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.01∶0.01;按最佳反應(yīng)溫度在Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)實(shí)時(shí)濁度儀擴(kuò)增曲線效果及反應(yīng)管在多色熒光成像系統(tǒng)內(nèi)的成像效果確定引物最佳濃度及其比例。

1. 5 二重?zé)晒釲AMP結(jié)果判定

二重?zé)晒釲AMP在實(shí)時(shí)濁度儀反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)內(nèi)，選擇多通道凝膠成像。由于ALV-Probe 5'端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為FAM，通道1選擇520 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，ALV陽(yáng)性產(chǎn)物反應(yīng)管在該通道顯示綠色熒光，而陰性對(duì)照管無(wú)綠色熒光;CIAV-Probe 5'端標(biāo)記的熒光基團(tuán)為CY5，通道2則選擇670 nm發(fā)射波長(zhǎng)，CIAV陽(yáng)性產(chǎn)物反應(yīng)管在該通道下顯示紅色熒光，而陰性對(duì)照管無(wú)紅色熒光;當(dāng)反應(yīng)管中既有ALV陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物又有CIAV陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，反應(yīng)管在2個(gè)通道下均能發(fā)出熒光，且反應(yīng)管顯示橘黃色。

1. 6 二重?zé)晒釲AMP特異性試驗(yàn)

根據(jù)1.4的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，逐一將陽(yáng)性ALV（A亞群、B亞群和J亞群）、CIAV、ALV及CIAV混合模板，以及FAdV-4、ARV、NDV、AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、AEV、REV、IBV、IBDV和MDV的cDNA/DNA模板加入LAMP反應(yīng)體系中，以驗(yàn)證二重?zé)晒釲AMP的特異性。

1. 7 二重?zé)晒釲AMP靈敏度試驗(yàn)

1. 7. 1 單一病原體模板檢測(cè)的靈敏度分析 制備好的ALV和CIAV陽(yáng)性重組質(zhì)粒按計(jì)算出的拷貝數(shù)，分別梯度稀釋為106、105、104、103、102、101和100拷貝/?L。根據(jù)1.4的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，取不同濃度的重組質(zhì)粒2.0 ?L依次加入反應(yīng)管中，混勻后置于Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中進(jìn)行反應(yīng)。

1. 7. 2 2種病原體模板同時(shí)檢測(cè)的靈敏度分析

將ALV和CIAV陽(yáng)性重組質(zhì)粒等量混合，然后梯度稀釋為106、105、104、103、102、101和100拷貝/?L，根據(jù)1.4的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，取不同濃度的重組質(zhì)粒2.0 ?L依次加入反應(yīng)管中，混勻后置于Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中進(jìn)行反應(yīng)。

1. 8 臨床樣品檢測(cè)

使用建立的二重?zé)晒釲AMP對(duì)13份臨床樣品（咽喉和泄殖腔棉拭子）進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與這2種病毒的常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證二重?zé)晒釲AMP的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 二重?zé)晒釲AMP反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

將含20.0 ?L反應(yīng)混合物的反應(yīng)管置于Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀中，分別于60、61、62、63和64 ℃下反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度為62 ℃時(shí)，濁度儀曲線圖的空白對(duì)照未起峰，且ALV和CIAV在此溫度下最早進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，因此確定最佳反應(yīng)溫度為62 ℃。ALV-FIP/ALV-BIP∶CIAV-FIP/CIAV-BIP∶ALV-F3/ALV-B3∶CIAV-F3/CIAV-B3∶ALV-Probe∶CIAV-Probe的最佳終濃度（μmol/L）比例為1.60∶1.60∶0.10∶0.10∶0.01∶0.02。

優(yōu)化后的二重?zé)晒釲AMP反應(yīng)體系20.0 μL：DNA/cDNA模板2.0 μL，2×Reaction Mix 10.0 μL，Bst DNA聚合酶0.8 μL，內(nèi)引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP（工作濃度40.0 μmol/L）各0.8 μL，外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作濃度5.0 μmol/L）各0.4 μL，ALV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.4 μL，CIAV-Probe（工作濃度0.5 μmol/L）0.8 μL，以ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：62 ℃反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。

2. 2 二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法僅擴(kuò)增出陽(yáng)性ALV（A亞群、B亞群和J亞群混合模板）的cDNA和CIAV的DNA，部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1所示。ALV陽(yáng)性反應(yīng)管在520 nm通道下呈綠色熒光，CIAV陽(yáng)性反應(yīng)管在670 nm通道下呈紅色熒光，ALV和CIAV混合模板在2個(gè)通道下均呈現(xiàn)出相應(yīng)的熒光，混合色呈橘黃色，而其他病毒和空的對(duì)照均未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物及發(fā)出熒光（圖2）。

2. 3 二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果

采用建立的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法分別檢測(cè)單模板ALV和CIAV的敏感性，實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，單獨(dú)檢測(cè)ALV cDNA模板或CIAV DNA模板的下限均為102拷貝/?L（圖3-A和圖4-A），將實(shí)時(shí)濁度儀反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)中，熒光結(jié)果也顯示在單模板存在的情況下，2種病原體的最低檢測(cè)下限均為102拷貝/?L（圖3-B和圖4-B）。同時(shí)檢測(cè)ALV cDNA模板和CIAV DNA模板時(shí)，ALV的檢測(cè)下限為102拷貝/?L，CIAV的檢測(cè)下限為103拷貝/?L（圖5）。

2. 4 二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用效果

采用建立的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法對(duì)13份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果的吻合率達(dá)100%。13份臨床樣品中，有5份樣品為CIAV單一感染，有1份樣品為ALV單一感染，有1份樣品為ALV和CIAV混合感染（圖6）。

3 討論

LAMP具有檢測(cè)快速、敏感度高、特異性好且無(wú)需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨床病原診斷（Peng et al.，2011;彭宜等，2013;Xie et al.，2014;Luo et al.，2015），但至今應(yīng)用較成熟的均為單重LAMP檢測(cè)方法。近年來(lái)，多重LAMP檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)成為鑒別不同動(dòng)物病原體的研究熱點(diǎn)（姜侃等，2015;Nyan and Swinson，2015;范晴等，2017;李森等，2018）。常規(guī)LAMP檢測(cè)結(jié)果的判定主要依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物直接凝膠電泳觀察梯形條帶、實(shí)時(shí)濁度儀形成的副產(chǎn)物磷酸鎂曲線、肉眼判斷白色沉淀及擴(kuò)增產(chǎn)物加入熒光顯色劑顯色等方法，但這些方法均不能準(zhǔn)確地對(duì)多重病原體進(jìn)行鑒別診斷。目前，國(guó)內(nèi)研究報(bào)道能實(shí)現(xiàn)真正意義上鑒別診斷的多重LAMP有3種方法：①基于擴(kuò)增產(chǎn)物酶切處理的特異序列識(shí)別法，通過(guò)在LAMP內(nèi)引物中引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增完畢后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理，然后根據(jù)酶切產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中的不同位置來(lái)區(qū)分不同產(chǎn)物，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且需要開蓋處理產(chǎn)物，增加了擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染的風(fēng)險(xiǎn)（范晴等，2017）。②依賴于熒光PCR檢測(cè)儀，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線出現(xiàn)特征峰的不同熔解溫度判斷病原體，但該方法可能由于同一病原體不同來(lái)源模板其擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度不同，而導(dǎo)致判斷結(jié)果出現(xiàn)偏差，具有一定的局限性（姜侃等，2015）。③在內(nèi)引物FIP的5'端引入不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后能在不同發(fā)射波長(zhǎng)通道下發(fā)出不同熒光，而以此區(qū)分不同病原體，但該方法也需開蓋電泳，易造成實(shí)驗(yàn)室污染（范晴等，2018）。

在參考方慶等（2020）建立雞細(xì)小病毒（ChPV）熒光LAMP檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)在ALV和CIAV靶基因上的F1c和B1c引物間設(shè)計(jì)攜帶不同熒光基團(tuán)的雙標(biāo)記探針，依靠靶基因不斷擴(kuò)增導(dǎo)致探針不斷裂解，將帶有陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管置于多色熒光成像系統(tǒng)中，陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物在相應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)通道內(nèi)發(fā)出熒光，根據(jù)熒光顏色能準(zhǔn)確判定病原體，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①設(shè)計(jì)的探針只與特異性模板發(fā)生雜交，增加了反應(yīng)的特異性，避免假陽(yáng)性;②檢測(cè)反應(yīng)只需60 min，且可在水浴鍋內(nèi)完成反應(yīng)，反應(yīng)敏感高效;③無(wú)需開蓋即能準(zhǔn)確判定結(jié)果，污染風(fēng)險(xiǎn)小。本研究采用2種熒光基團(tuán)（FAM和CY5），但這2種熒光基團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)不同，分別是520和670 nm，在完成LAMP反應(yīng)后只需將反應(yīng)管置于多色熒光系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行觀察，在520 nm通道下能觀察到ALV陽(yáng)性反應(yīng)管呈綠色熒光，在670 nm通道下能觀察到CIAV陽(yáng)性反應(yīng)管呈紅色熒光，二者互不干擾，而其他病毒和空白對(duì)照均不發(fā)光，因此能準(zhǔn)確判斷檢測(cè)結(jié)果。由于二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法涉及到熒光探針，其價(jià)格相對(duì)較高，加之二重LAMP檢測(cè)方法需配備多色熒光系統(tǒng)才能進(jìn)行觀察判定，也增加檢測(cè)成本，因此該方法不易在基層和現(xiàn)場(chǎng)推廣引用。

4 結(jié)論

建立的二重?zé)晒釲AMP檢測(cè)方法能實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管內(nèi)鑒別診斷ALV和CIAV，具有特異性好、敏感性高及污染風(fēng)險(xiǎn)小等優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)多色熒光系統(tǒng)進(jìn)行肉眼觀察，適用于ALV和CIAV的臨床快速篩查。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）