魚源膠原肽特征質(zhì)量指標(biāo)檢測分析

牛林林，袁丹丹，陳 磊，蔡久慶，劉 娟，張 明，陳 勉，張曉元，張艷艷，劉 飛＊

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南 250101；2. 東阿生力源阿膠股份有限公司 聊城市阿膠多肽提取技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 聊城 252218）

膠原肽，又稱膠原水解物，是由膠原蛋白衍生的短鏈氨基酸，由膠原蛋白經(jīng)過熱處理、酸堿酶酶解，發(fā)生分子鏈解體、斷裂，再經(jīng)加工所得產(chǎn)物[1]。膠原肽主要來源于骨骼、牛皮、豬皮、魚類和家禽等[2-4]，作為小分子蛋白肽，具有生物可利用性，易分解，并能很好地被吸收到血液中，可在全身傳播、修復(fù)和提供能量[5-8]。

Koji等[6]研究表明，口服膠原肽1～2 h后，可在人體血液中檢測到羥脯氨酸濃度升至峰值，以肽的形式存在，主要是三肽Gly-Pro-Hyp。Kim等[9]研究表明，小分子膠原肽可從血管轉(zhuǎn)移到表皮系統(tǒng)，從而刺激皮膚成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白、彈性纖維和透明質(zhì)酸，改善皮膚的光滑度，增加皮膚的柔韌性和彈性。研究表明[10-11]細(xì)胞可將轉(zhuǎn)移至組織中的多肽構(gòu)建成完整的膠原螺旋，修復(fù)皮膚、骨骼和關(guān)節(jié)，對骨質(zhì)疏松有一定預(yù)防和治療作用。由于膠原肽富含多種氨基酸，具有營養(yǎng)和生理調(diào)節(jié)雙重作用，廣泛用于膳食食品、保健食品、美容食品、運(yùn)動營養(yǎng)食品等領(lǐng)域[12-13]。

隨著膠原肽市場規(guī)模增大，不同來源的膠原肽檢測標(biāo)準(zhǔn)有所差異，表1為不同檢測標(biāo)準(zhǔn)（依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)）中膠原肽的理化指標(biāo)。相對分子質(zhì)量、羥脯氨酸的含量是區(qū)別一般食品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)，國標(biāo)GB 31645-2018中膠原蛋白肽比魚源膠原肽的指標(biāo)范圍寬泛，魚源膠原肽的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的膠原肽相對分子質(zhì)量（Mr）和羥脯氨酸含量差異也較大。

表1 不同檢測標(biāo)準(zhǔn)中膠原肽理化指標(biāo)

由于標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)的差異，市售魚源膠原肽的產(chǎn)品質(zhì)量信息基本相似，大多未標(biāo)明低分子量氨基酸（Mr小于1000 ）占比，以及包含特征氨基酸羥脯氨酸在內(nèi)的氨基酸組成差異，售價(jià)差異較大，消費(fèi)者難以合理選擇。因此本文選取了4種不同品牌，具有代表性的魚源膠原肽產(chǎn)品與本實(shí)驗(yàn)室研制的膠原肽進(jìn)行特征質(zhì)量指標(biāo)檢測分析，旨在篩選出低分子量占比較高，特征性氨基酸羥脯氨酸較高的魚源膠原肽，為魚源膠原肽產(chǎn)品選擇和功效研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；無水乙醇、鹽酸、苯酚（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；三氟乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、十水合四硼酸鈉、硼酸（分析純，國藥集團(tuán)）；18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、OPA衍生試劑（島津公司AJS-01 氨基酸柱前衍生化方法包）；細(xì)胞色素C（95 %，Mr：12 355）；抑肽酶（6000 U/mg，Mr：6511）；桿菌酶（Mr：1450）；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（97 %，Mr：451）；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（97 %，Mr：189）。

產(chǎn)品1～4購于市場中不同品牌的膠原肽，X肽由本實(shí)驗(yàn)室研制，均為魚源膠原肽。

2 方法

2.1 微波消解處理

將產(chǎn)品1～4和X肽每件樣品準(zhǔn)確稱取約0.1 g，各置于微波消解罐中，已有樣品的各消解罐中分別加入5 ml 鹽酸（1 %苯酚）和5 ml 純凈水，進(jìn)行微波消解，1600 W，150 ℃，15 min。微波消解程序完成并冷卻后，分別將消解液定容至100 ml，各取出1 ml液體分別置于蒸發(fā)皿中60 ℃蒸發(fā)干燥后，各加入1 ml的稀鹽酸將溶質(zhì)溶出，置試管中待測。

2.2 GPC方法測定膠原肽相對分子質(zhì)量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸適量，分別用流動相配制成濃度為1.0 g的不同相對分子質(zhì)量的肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用孔徑為0.2 μm濾膜過濾后分別進(jìn)樣，得到系列標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以相對分子質(zhì)量的對數(shù)（lg Mr）對保留時(shí)間作圖或作線性回歸得到Mr校正曲線及其方程。

2.2.2 樣品的配制 稱取樣品125.0 mg，用流動相溶解并定容至25 ml，超聲振蕩10 min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2 μm，0.5 μm聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾，其濾液用于測定。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：TSKgel G2000SWxL凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm，5 μm），流動相：乙腈-水-三氟乙酸（40:60:0.05）；檢測波長：220 nm；流速：0.5 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μl；等梯度洗脫。

2.3 OPA柱前衍生法測定膠原肽氨基酸含量

2.3.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液 含18種氨基酸，Asp（門冬氨酸）、Glu（谷氨酸）、Ser（絲氨酸）、His（組氨酸）、Gly（甘氨酸）、Thr（蘇氨酸）、Arg（精氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Val（纈氨酸）、Met（甲硫氨酸）、Ile（異亮氨酸）、Phe（苯丙氨酸）、Lys（賴氨酸）、Leu（亮氨酸）、Hyp（羥脯氨酸）、Pro（脯氨酸）濃度均為2.5 μmol/ml，Cys（半胱氨酸）為1.25 μmol/ml。

數(shù)控專業(yè)是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的專業(yè)，其中涉及到很多抽象的理論知識，對于剛剛接觸這些知識的學(xué)生而言，在學(xué)習(xí)時(shí)極易遇到一些困難。所謂數(shù)字化課程，其是將網(wǎng)絡(luò)作為支持環(huán)境，運(yùn)用數(shù)字化學(xué)習(xí)材料，使用數(shù)字化信息傳遞與人際交互方式的一種教學(xué)方式。在科學(xué)技術(shù)發(fā)展之下，數(shù)字化課程成為當(dāng)前教育行業(yè)中一種新型輔助性教學(xué)方式，可以有效提升教學(xué)質(zhì)量與效率。

2.3.2 衍生用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，置入2 ml樣品瓶，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl，0.l mol/L鹽酸溶液400 μl，混勻，作為衍生用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.3 衍生用游離氨基酸樣品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取樣品適量，加0.l mol/L鹽酸溶液制成氨基酸總濃度約為100 mg/ml溶液作為檢測游離氨基酸樣品溶液（溶液pH應(yīng)不小于1.0），準(zhǔn)確量取樣品溶液500 μl，置入2 ml樣品瓶，準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl，混勻，作為衍生用游離氨基酸樣品溶液。

2.3.4 衍生用微波消解后樣品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取樣品適量，加0.l mol/L鹽酸溶液制成氨基酸總濃度約為1 mg/ml溶液作為檢測微波消解后總氨基酸樣品溶液（溶液pH應(yīng)不小于1.0），準(zhǔn)確量取樣品溶液500 μl，置入2 ml樣品瓶，準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl，混勻，作為衍生用微波消解后樣品溶液。

2.3.5 色譜條件 色譜柱：AJS-02 氨基酸分析專用柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A：0.45 %Na2HPO3·12H2O-0.475 %Na2B4O7·10H2O，pH 8.2；流動相B：甲醇-乙腈-水（450:450:100，v/v/v）；檢測波長：UV 檢測器：338 nm（一級氨基酸），262 nm（二級氨基酸）；流速：1.6 ml/min；柱溫：50 ℃；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

3 結(jié)果與分析

3.1 膠原肽相對分子質(zhì)量結(jié)果與分析

3.1.1 不同樣品分子質(zhì)量的分布情況 分別測定產(chǎn)品1～4和X肽，結(jié)果見圖1，色譜圖均較好地顯示了5種不同來源膠原肽樣品中不同分子質(zhì)量的分布情況。

圖1 不同樣品的Mr色譜圖

采用SHIMADZU GPC數(shù)據(jù)處理軟件分別對以上色譜圖進(jìn)行處理。洗脫物質(zhì)的分子質(zhì)量隨保留時(shí)間增加而減小。由圖1可見，產(chǎn)品1～4的出峰時(shí)間相對一致，則分子質(zhì)量大小差別不大，X肽出峰時(shí)間較晚，峰型相對單一，則X肽分子質(zhì)量較小。產(chǎn)品1～4及X肽中一些主要色譜峰的保留時(shí)間、重均相對分子質(zhì)量（Mw）、數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）、多分散系數(shù)d（Mw/Mn）的基本情況見表3。

由表3可見，產(chǎn)品1～4的Mw主要集中在1000～2000之間，X肽的Mw相對較小，主要集中在1000以下，占比約為88.47 %，比產(chǎn)品1～4Mw小于1000的低分子量組分占比高約92.75 %～115.62 %。

表3 不同產(chǎn)品相對分子質(zhì)量及其分布測定結(jié)果

3.1.2 不同樣品相對分子質(zhì)量占比 對產(chǎn)品1～4和X肽進(jìn)行了相對分子質(zhì)量占比統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2。

圖2 不同膠原肽產(chǎn)品Mr占比

由圖2可見，產(chǎn)品1～4中相對分子質(zhì)量的占比大小基本相同，X肽中低分子量占比遠(yuǎn)高于市售樣品的魚源膠原肽。

3.2 膠原肽氨基酸結(jié)果與分析

3.2.1 氨基酸對照品 對20種氨基酸對照品進(jìn)行高效液相分析，結(jié)果見圖3。

圖3 混合氨基酸對照品HPLC圖

3.2.2 不同樣品中游離氨基酸含量 將產(chǎn)品1～4和 X肽進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果見圖4。

由圖4可見，各產(chǎn)品中游離氨基酸含量較少。產(chǎn)品1中精氨酸含量最高為67.37 μg/ml，其他17種氨基酸的含量均不超過50 μg/ml；產(chǎn)品2中丙氨酸的含量最高為112.18 μg/ml，其他均不超過50 μg/ml；產(chǎn)品3和產(chǎn)品4中氨基酸含量均不超過50 μg/ml；X肽中亮氨酸含量最高為65.79 μg/ml，其它均未超過40 μg/ml，其中羥脯氨酸的含量為0。上述結(jié)果表明，產(chǎn)品1～4和X肽中游離氨基酸濃度為0.2 %～0.5 %，表明樣品主要以低聚肽的形式存在。

圖4 市售樣品和X肽中游離氨基酸含量

3.2.3 水解后不同樣品游離氨基酸含量 對產(chǎn)品1～4和X肽按照“2.1”項(xiàng)方法微波消解后進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果見圖5。

圖5 水解后不同樣品中氨基酸含量

由圖5可見，將市售樣品和X肽水解后，各種氨基酸的含量均明顯增加，多數(shù)氨基酸含量高于100 μg/ml，產(chǎn)品1～4和X肽氨基酸含量變化趨勢較相似。產(chǎn)品2、產(chǎn)品3、產(chǎn)品4和X肽中谷氨酸含量約為300 μg/ml，產(chǎn)品1谷氨酸含量為229.67 μg/ml；各樣品中甘氨酸含量約為500 μg/ml，精氨酸含量約為150 μg/ml，丙氨酸含量約為200 μg/ml。其中特征氨基酸羥脯氨酸和脯氨酸含量差別較大，X肽的羥脯氨酸（228.71 μg/ml）和脯氨酸（286.98 μg/ml）含量明顯高于市售樣品。

3.2.4 不同樣品中肽氨基酸組成含量 各樣品水解之后氨基酸含量減去未水解之前的氨基酸含量，得樣品的肽氨基酸組成含量，結(jié)果見圖6。

圖6 不同樣品中肽氨基酸組成含量

由圖6可見，本次實(shí)驗(yàn)共檢測18種氨基酸，X肽中有17種氨基酸含量高于產(chǎn)品1，13種氨基酸含量高于產(chǎn)品2，14種氨基酸含量高于產(chǎn)品3，13種氨基酸含量高于產(chǎn)品4；尤其特征性氨基酸羥脯氨酸和脯氨酸的含量（分別為228.71，166.41 μg/ml）遠(yuǎn)高于市售4種產(chǎn)品（羥脯氨酸分別為145.58，75.81，52.66，122.49 μg/ml，脯氨酸分別為208.3，170.57，166.41，196.16 μg/ml）。

3.2.5 羥脯氨酸在不同膠原肽產(chǎn)品中的比例 根據(jù)HPLC檢測出的羥脯氨酸和脯氨酸的含量，計(jì)算羥脯氨酸和脯氨酸在膠原肽中的占比，結(jié)果見圖7。

圖7 羥脯氨酸和脯氨酸占比

由圖7可見，X肽中羥脯氨酸含量較高，比產(chǎn)品1～4高約50.91% ～332.11 %；脯氨酸含量比產(chǎn)品1～4中含量高約33.91 %～71.41 %。

4 結(jié)論和討論

不同魚源膠原肽產(chǎn)品的低分子量組分占比、特征性氨基酸和其他氨基酸含量存在明顯差別。本文以實(shí)驗(yàn)室研制的X肽與4種市售魚源膠原肽微波消解后進(jìn)行分子量大小和氨基酸含量比較。結(jié)果表明，X肽具有低分子量組分、羥脯氨酸、脯氨酸含量高的特點(diǎn)，更易被人體吸收和發(fā)揮功效。以上述關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)為指針，通過優(yōu)化不同來源底物、酶解工藝和篩選高活性肽段，達(dá)到降低產(chǎn)品用量提高產(chǎn)品功效的效果，將是以后研究的重點(diǎn)。同時(shí)，本文為膠原肽質(zhì)量控制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。