王 浩 于港華 侯 穎 侯思宇 韓淵懷 李紅英 邢國芳

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

谷子(Setariaitalica)是重要的雜糧作物，籽粒脫殼后稱 “小米”，具有很高的食用和營養(yǎng)價值[1]。研究表明，小米是良好的作物富硒載體[2]，篩選和培育高硒含量的谷子品種成為解決人體缺硒狀態(tài)的有效途徑[3-4]，同時建立一種安全高通量測定小米硒含量的方法對于促進(jìn)富硒谷子產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

目前，小米總硒含量的測定主要采用GB 5009.93—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測定》，此法主要包括樣品預(yù)處理以及化學(xué)分析測定過程實現(xiàn)對硒含量的精確測定，但化學(xué)分析法在測定大批量樣品時預(yù)處理較多，過程繁雜；同時，化學(xué)分析期間的樣品處理會用到濃硫酸等劇毒危化品，從而產(chǎn)生廢料而污染環(huán)境。20世紀(jì)60年代，Norris等[5]首先應(yīng)用近紅外技術(shù)對谷物中的蛋白質(zhì)、水分等含量進(jìn)行測定分析，并且研究利用近紅外光譜分析技術(shù)測定其他農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)性狀。朱麗偉等[6]采用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合定量偏最小二乘法對多年生苦蕎葉片蛋白質(zhì)和γ-氨基丁酸(GABA)含量進(jìn)行了快速測定研究，證明了使用近紅外光譜技術(shù)定量測定多年生苦蕎葉片蛋白質(zhì)和GABA含量的可行性以及模型的穩(wěn)定性。閔順耕等[7]建立了大麥蛋白質(zhì)、淀粉和賴氨酸的近紅外分析模型決定系數(shù)R2分別為0.985、0.973和0.978。白琪林等[8]利用近紅外反射光譜法(NIRS)對青貯玉米的體外干物質(zhì)消化率、中性洗滌纖維含量進(jìn)行測定分析，采用主成分分析和偏最小二乘回歸法，建立了一套測定青貯玉米相關(guān)指標(biāo)的近紅外反射光譜技術(shù)。目前，應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)分析作物含水量、淀粉、蛋白質(zhì)已有許多相關(guān)報道[9]。Duan等[10]采用PLS建模算法建立了煙草中Fe，Mn，Mo，Ca，Mg等元素的回歸模型，決定系數(shù)均達(dá)到0.7以上，這表明煙草中的無機(jī)元素能夠與有機(jī)酸等物質(zhì)相螯合從而間接被近紅外反射光譜所測定。Moros等[11]利用NIRS預(yù)測了紅辣椒粉末中As和Pb的含量，預(yù)測集的決定系數(shù)分別為0.87和0.99；張龍等[12]使用小波變換預(yù)光譜預(yù)處理結(jié)合徑向基人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)測了受污染的水稻葉片中Hg，Cd，Pb元素，識別正確率分別為0.955，0.818和0.913，余恩[13]采用近紅外反射光譜測定評價288份棉籽無機(jī)元素含量時，發(fā)現(xiàn)Ca、Ni、Se和Sr全光譜PLS模型中R2值較高，分別為0.861 9、0.817 9、0.814 4和0.806 9，這表明近紅外反射光譜可以定量測定無機(jī)元素中某些微量元素。盡管近紅外反射光譜在其他作物中檢測品質(zhì)性狀及元素含量已有許多報道，但是針對小米總硒含量的測定未見報道。本研究擬采用近紅外漫反射光譜技術(shù)測定小米的近紅外光譜，采用偏最小二乘法對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，構(gòu)建小米硒含量的近紅外分析模型，以期為實現(xiàn)小米硒含量的快速檢測提供參考。

1 試驗方法

1.1 材料及儀器

試驗材料為2020年秋季采收的不同遺傳背景的谷子穗，建立模型時，去除不適宜建模的異常樣本后選取93 份不同品種的谷子將其分為建模集(樣本容量n=51)和驗證集(n=42)?？挤N脫粒后采用礱谷機(jī)對谷子脫殼，采用色選機(jī)挑選米色均勻，籽粒完整的小米后使用快速組織研磨儀磨成粉末，稱取12 g，過100 目篩，待用。

本研究采用的近紅外光譜儀為丹麥生產(chǎn)的NIRSTMDS2500臺式近紅外光譜儀，主要參數(shù)見表1。

表1 NIRSTMDS2500光譜儀器主要參數(shù)Table 1 Main parameters of NIRSTMDS2500 spectrometer

1.2 方法

1.2.1小米光譜采集

NIRSTMDS2500近紅外光譜儀設(shè)置參數(shù)為，積分時間10 000 μs/次，積分次數(shù)為400。通過網(wǎng)絡(luò)信號光纜連通外部測試器和電腦，光源為35 W鹵素?zé)?，入射孔徑? cm光斑大小，分辨率為0.5 nm，波長范圍850～2 500 nm。光譜采集方式為漫反射，樣品杯選用小樣品杯，為防止外界光源干擾，對光譜儀進(jìn)行外置氧化鋁材質(zhì)遮光蓋，每掃描10 個樣品進(jìn)行1次白板校正，每個樣品分為3 等份，分別保存掃描光譜后的樣品，避免混樣。

1.2.2化學(xué)參比值設(shè)定

根據(jù)GB 5009.93—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測定》[14]中第一法—氫化物原子熒光法測定小米總硒含量。使用遠(yuǎn)紅外石墨消解儀對待測樣品消煮，使用AFS 2202a原子熒光光度計測定小米硒含量，每個待測樣品平行測定3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.3模型構(gòu)建及數(shù)據(jù)處理

2 模型建立與檢驗

2.1 樣品化學(xué)測定結(jié)果

利用化學(xué)測定方法對建模集和預(yù)測集的樣品進(jìn)行總硒含量的測定，統(tǒng)計參數(shù)見表2。建模集和預(yù)測驗證集的小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值分別為0.093和0.206 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.083和0.124 mg/kg，變異系數(shù)分別為0.890和0.602?；瘜W(xué)測定的建模集小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最大值為0.435 mg/kg，最小值為0.006 mg/kg，化學(xué)測定的預(yù)測集小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最大值為0.481 mg/kg，最小值為0.032 mg/kg。結(jié)果顯示，建模集小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍是0.006～0.435 mg/kg，而預(yù)測集小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化范圍為0.032～0.481 mg/kg，兩者范圍接近，可用于近紅外反射光譜的分析。因此，這93份樣品可以用于構(gòu)建小米總硒含量的預(yù)測模型。

表2 建模集和預(yù)測集小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)統(tǒng)計描述Table 2 Statistical description of the total selenium content of foxtail millet in the modeling set and prediction set

2.2 小米的近紅外光譜特征

在近紅外光譜區(qū)，含氫官能團(tuán)的合頻以及倍頻的基本振動均能影響近紅外光譜的吸收峰，而樣品中的有機(jī)化合物含量變化影響含氫官能團(tuán)的振動吸收強(qiáng)度[15]，無機(jī)元素?zé)o含氫基團(tuán)故在近紅外區(qū)沒有吸收峰，理論上不能利用近紅外光譜技術(shù)測定其物質(zhì)含量。但樣品中無機(jī)元素通常不是以單一的離子形態(tài)存在的，而是與一些有機(jī)物質(zhì)結(jié)合，形成絡(luò)合物或螯合物進(jìn)而能夠間接地測定無機(jī)元素的含量，或無機(jī)元素的含量與樣品中某些常量組份含量之間存在高度的相關(guān)性，這就使近紅外測定無機(jī)元素成為可能[16-19]。植物體內(nèi)含有較少的無機(jī)硒，一般以四價硒的形態(tài)出現(xiàn)；而有機(jī)硒多以富含硒的蛋白、多糖、核酸、RNA、硒代氨基酸及各種甲基硒化物等形式存在，其中以硒蛋白含量最高[20]，同時硒蛋白與小米有機(jī)硒含量呈正相關(guān)[21]，而小米的總硒含量是有機(jī)硒和無機(jī)硒的總和[22]，因此，可以利用近紅外反射光譜檢測小米總硒含量并監(jiān)測其變化情況。

分析近紅外光譜主要是對原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，處理方法包括導(dǎo)數(shù)處理、中心化和基線校正等。本研究為提高校正方程的準(zhǔn)確性，減小基線漂移，對原始光譜的反射率R求倒數(shù)后再對其進(jìn)行對數(shù)處理得到原始光譜吸光值(log(1/R))，利用51份樣品的吸光值為縱坐標(biāo)建立近紅外原始光譜曲線(圖1(a))。

(a)原始光譜；(b)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換SNV和卷積平滑Detrend處理后的光譜；(c)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換SNV、卷積平滑Detrend和一階求導(dǎo)后的光譜。(a) The original wavelength range； (b) The spectrum wavelength range after standard normal transformation SNV and convolution smoothing Detrend processing； (c) The spectrum wavelength range after standard normal transformation SNV, convolution smoothing Detrend and first-order derivative.圖1 小米近紅外光譜不同預(yù)處理階段光譜曲線Fig.1 Spectral curves of foxtail millet near-infrared spectroscopy at different preprocessing stages

原始光譜較平滑沒有明顯的拐點，無法在光譜中直接分辨噪音信息[23]，并且原始光譜存在基線漂移，基線漂移主要與水分的含量相關(guān)，一般水分含量越高，原始光譜的基線偏移就越大[24]，與此同時原始光譜也存在一些無效信息，如環(huán)境因素和儀器本身因素的干擾。

為了消除測定過程中的噪音，提高校正方程的準(zhǔn)確度和可靠性，本研究對小米近紅外原始光譜(圖1(a))進(jìn)行了預(yù)處理。首先利用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變化SNV和卷積平滑Detrend等方法對原始光譜進(jìn)行處理，從而消除小米粉末固體顆粒大小、表面散射和光程變化對光譜的影響，處理后平滑點數(shù)為4，光譜的吸收特性得到顯著增強(qiáng)(圖1(b))；其次采用一階導(dǎo)數(shù)處理，重疊峰和基線影響基本得到消除，得到標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換SNV、卷積平滑Detrend和一階求導(dǎo)后的光譜(圖1(c))。最終原始光譜經(jīng)過預(yù)處理后，大幅提升了光譜的信噪比，滿足近紅外校正模型的構(gòu)建和校正模型性能檢測的要求。根據(jù)頻率不同，近紅外的光譜區(qū)可分為低頻、合頻和高頻區(qū)，為保證模型的可靠性，建立模型時選擇全光譜區(qū)域，應(yīng)用PLSR(偏最小二乘法)算法建立模型。

2.3 模型建立

圖2 校正集小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)化學(xué)參比值和近紅外模型預(yù)測值回歸曲線Fig.2 Regression curve of the chemical reference value of the calibrated set foxtail millet selenium mass fraction and the predicted value of the near-infrared model

2.4 預(yù)測集的檢驗

本研究利用未參與校正模型構(gòu)建的42 份樣本組成的預(yù)測驗證集對校正模型進(jìn)行外部驗證，以期評價小米總硒含量校正模型的預(yù)測能力。建立外部預(yù)測集小米總硒含量的化學(xué)參比值與近紅外預(yù)測值的回歸曲線(圖3)來描述近紅外外部驗證模型中化學(xué)參比值和校正模型預(yù)測值之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，預(yù)測值與化學(xué)參比值的相關(guān)系數(shù)為0.881，因此，所建立的模型可用于小米總硒含量的檢測。

圖3 外部預(yù)測集小米總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)化學(xué)參比值與近紅外預(yù)測值回歸曲線Fig.3 The regression curve between the chemical reference value of the foxtail millet selenium mass fraction and the near-infrared predicted value in the external prediction set

3 結(jié)論與討論

采用近紅外光譜分析技術(shù)建立模型可以更加高效地檢測小米總硒含量。從便捷、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保地實現(xiàn)多樣品硒含量檢測的角度來說，可以替代化學(xué)測定法。